قياس انقباض القلب في الخلايا العضلية الأولية البشرية البالغة المعزولة

تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. كانت جميع القلوب البشرية المستخدمة في الدراسات غير قابلة للزرع وتم الحصول عليها أخلاقيا بموافقة قانونية مستنيرة (الشخص الأول أو أقرب الأقرباء) من المتبرعين بالأعضاء الجثثية في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة). تمت الموافقة المسبقة على بروتوكولات الاسترداد والتجارب في المختبر من قبل مجالس المراجعة المؤسسية (IRBs) في مراكز الزرع داخل شبكة زراعة الأعضاء الأمريكية (OPTN). علاوة على ذلك ، يمكن تتبع جميع عمليات نقل قلوب المتبرعين بالكامل ومراجعتها بشكل دوري من قبل السلطات الفيدرالية الأمريكية. ملاحظة: تطبيق جميع إجراءات السلامة اللازمة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول ، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل معاطف المختبر ونظارات السلامة والقفازات). 1. عزل خلايا عضلة القلب (يوم واحد قبل قياس الانقباض) أعد تشغيل قلوب المتبرعين فور وصولها إلى المختبر باستخدام محلول شلل القلب المثلج6 وعزل الخلايا العضلية الأولية البشرية البالغة إنزيميا من البطينين11،12،13،14،15. بعد ذلك ، حافظ على خلايا عضلة القلب معلقة وقم بتخزينها ب 10 مل من المحلول A (110 مللي متر سكروز ، 0.005 مللي مول CaCl 2 ، 3 mM MgCl 2 ، 70 mM KOH ، 60 mM حمض اللاكتوبيونيك ، 10 mM KH 2 PO4 ، 20 mM توراين ، 20 mM L- هيستيدين ، 20 mM HEPES ، 2 mM L- حمض الجلوتاميك ، 2 mM L- (-) – حمض الماليك ، درجة الحموضة 7.4 مع KOH) في 20 مل قارورة ويتون (جدول المواد) في درجة حرارة مبردة حتى يتم استجوابها تجريبيا.ملاحظة: قم بتخزين 200000 خلية لكل قارورة. 2. إعداد طلاء Laminin (1 يوم قبل قياس الانقباض) ضع غطاء زجاجي واحد (25 مم × 25 مم مربع ، جدول المواد) في كل بئر من لوحة استزراع ثمانية آبار (جدول المواد). بعد ذلك ، قم بتغطية أغطية الأغطية باللامينين بتركيز 5 ميكروغرام / مل. للقيام بذلك ، أضف 800 ميكرولتر من مخزون Laminin 521 المؤتلف البشري (جدول المواد ، المخزن في -20 درجة مئوية) إلى 7.2 مل من المحلول B (145 mM NaCl ، 4 mM KCl ، 2.5 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl2 ، 11.1 mM Glucose ، و 10 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 مع NaOH) واخلطه جيدا. قم بإسقاط 200 ميكرولتر من محلول اللامينين المخفف في وسط كل غطاء. ثم غطي الطبق وركصيه في ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.ملاحظة: قم بإعداد عدة ألواح استزراع ذات ثمانية آبار لضمان وجود ما يكفي من أغطية الطلاء المطلية باللامينين. 3. إعداد خلايا عضلة القلب المتسامحة مع الكالسيوم2+ (في يوم قياس الانقباض) أخرج قنينة من الخلايا من الثلاجة ، ونضح المحلول A من القارورة وأضف 10 مل مبردة من المحلول B.ملاحظة: تأكد من عدم شفط الخلايا وتفريق المحلول B في القارورة عن طريق وضع الماصة داخل الجزء العلوي من جدار القارورة. قم بتغطية قارورة الخلايا ثم قم بتدويرها برفق للتأكد من تشتت الخلايا في جميع أنحاء المحلول (ب). أخيرا ، اترك الخلايا تستقر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). 4. إعداد نظام التسجيل (في يوم قياس الانقباض) ملاحظة: يشتمل نظام التسجيل على صندوق للتحكم في درجة الحرارة ، ومحفز ، ونضح مدفوع بالضغط يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ، وزجاجات تروية مدفوعة بالضغط ، وبرنامج اقتناء داخلي يسمح باختيار مناطق الاهتمام (ROIs) وعرض الانقباض العابر ، والمجهر المقلوب ، وغرفة الخلية ، والكاميرا (الشكل 1). قم بتشغيل نظام فراغ الشفط. بعد ذلك ، قم بإزالة غطاء المجهر ، وقم بتشغيله ، وقم بتوصيل الكاميرا (جدول المواد ، الشكل 1) ، وأخيرا ، تأكد من تشغيل المروحة لضمان عدم ارتفاع درجة حرارة الكاميرا. بعد ذلك ، قم بتشغيل لوحة تسخين المجهر (جدول المواد) وصندوق التحكم في درجة الحرارة (جدول المواد ، الشكل 1) ، واضبطها على درجة حرارة التشغيل المناسبة. بعد ذلك ، قم بتشغيل محفز المجال (جدول المواد ، الشكل 1) ونظام الضغط. أخيرا ، قم بتوصيل أنبوب المحلول (جدول المواد) بغرفة التسجيل (جدول المواد ، الشكل 1). 5. تحضير مركبات الاختبار (في يوم قياس الانقباض) تمييع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO; جدول المواد) 1000 ضعف في المحلول C (145 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 4 مللي مول KCl ، 1.8 مللي مول CaCl 2 ، 1 مللي متر MgCl2 ، 11.1 مللي متر جلوكوز ، و 10 مللي مول HEPES ، درجة الحموضة 7.4 مع NaOH) لصنع محلول مركبة DMSO بنسبة 0.1٪. لاختبار مركب عند 1 أضعاف و 10 أضعاف و 100 ضعف و 1000 ضعف من تعرضه العلاجي البالغ 0.001 ميكرومتر ، قم بإذابة مركب الاختبار في DMSO بتركيز 1 mM. قم بتخفيف هذا الحل بشكل متسلسل باستخدام DMSO لإنتاج ثلاثة مخزونات DMSO أخرى (على سبيل المثال ، 0.001 mM و 0.01 mM و 0.1 mM). أخيرا ، قم بتخفيف كل مخزون مركب اختبار بمقدار 1000 ضعف في 100 مل من المحلول C للحصول على تركيزات الاختبار النهائية (0.001 ميكرومتر ، 0.01 ميكرومتر ، 0.1 ميكرومتر ، و 1 ميكرومتر). أضف محلول السيارة ومحاليل التركيزات النهائية للميكرومولار للمركب إلى زجاجات زجاجية سعة 100 مل (جدول المواد ، الشكل 1) ثم قم بتوصيل الزجاجات بنظام التروية المدفوع بالضغط (جدول المواد ، الشكل 1). بعد ذلك ، قم بتجهيز نظام التروية ببرنامج يحركه الكمبيوتر (جدول المواد) باستخدام ضغط 200-300 ملي بار لتقديم تدفق تروية مستمر بمعدل 1.8 مل / دقيقة.ملاحظة: لا تقم بإجراء التجربة إذا وجد أن مركب الاختبار مرتبط بمشكلة الذوبان. أيضا ، قم بصياغة حلول الاختبار المركبة من محاليل المخزون في غضون 30 دقيقة قبل التطبيق التجريبي على الخلايا. 6. طلاء خلايا عضلة القلب (في يوم قياس الانقباض) خذ صفيحة من ثمانية آبار تحتوي على أغطية مغطاة باللامينين من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 4 درجات مئوية وضع غطاء واحد بعناية في غرفة تسجيل جيدة التنظيف (الشكل 1). ثم أعد الطبق المكون من ثمانية آبار إلى الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى الطلاء التالي.ملاحظة: استخدم منديلا خاليا من النسالة (جدول المواد) لمسح غطاء الغطاء المطلي مع الحفاظ على غطاء الغطاء مغطى بطبقة رقيقة من اللامينين. تأكد أيضا من التخلص من أغطية الغطاء المستخدمة في حاوية الأدوات الحادة. بعد ذلك ، خذ قارورة متصاعدة من الخلايا (الخطوة 3.2) ونضح المحلول B من القارورة للوصول إلى أصغر حجم ممكن دون فقد الخلايا (~ 200 ميكرولتر). بعد ذلك ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا في غرفة مجهر التسجيل المثبتة على مرحلة المجهر المقلوب (جدول المواد). دع الخلايا تستقر على الغطاء لمدة 5 دقائق. أثناء انتظار استقرار الخلايا تماما ، افتح مجال الرؤية على المجهر وحدد ما إذا كانت كثافة الخلية كافية (~ 70٪) لبدء التشغيل التجريبي.ملاحظة: تأكد من أن الشفط لا يستنشق جميع الخلايا بعيدا إذا تم الاستغناء عن أكثر من 200 ميكرولتر. 7. تسجيل انقباض عضلة القلب بعد اكتمال الطلاء ، قم بموازنة الخلايا لمدة 5 دقائق عن طريق تعطيرها باستمرار بالمحلول C باستخدام نظام التروية المدفوع بالضغط (جدول المواد). اضبط الشفط بشكل صحيح ، وقم بتشغيل كل من صندوق التحكم في درجة الحرارة ولوحة التسخين ، واضبطهما على التسليم ~ 35 °C. بعد ذلك ، قم بتحفيز الخلايا بجهد فوق العتبة بتردد سرعة 1 هرتز (نبضة ثنائية القطب مدتها 3 مللي ثانية) على محفز مجال مع زوج من الأسلاك البلاتينية الموضوعة على جوانب متقابلة من الغرفة متصلة بمحفز المجال. اضبط سعة النبض المحفز على 1 فولت ، ثم قم بزيادته حتى تبدأ خلايا عضلة القلب في توليد دورات انكماش واسترخاء. استخدم قيمة عتبة 1.5x طوال التجربة.ملاحظة: حدد الخلايا السليمة ذات التشكل على شكل قضيب والتشققات الواضحة. بعد ذلك ، اضبط مجال الرؤية وركز على عرض أكبر عدد ممكن من الخلايا المتقلصة (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، اعرض الصور الرقمية للخلايا داخل برنامج الاستحواذ لنظام تسجيل الانقباض البصري. يستخدم هذا البرنامج كاميرا عالية الدقة ومعدل إطارات عالي بمعدل 150 إطارا في الثانية (جدول المواد ، الشكل 1) لتسجيل دفق فيديو يحتوي على خلايا عضلية متعددة في نفس الإطار.ملاحظة: يوفر هذا دقة زمنية ومكانية كافية لالتقاط وقياس ديناميكيات القطعة العضلية للعديد من الخلايا العضلية السليمة في وقت واحد. يتم الاستفادة من المعالجات الحديثة ذات العد الأساسي العالي لتمكين الحساب المتوازي للتغيرات في طول القطعة العضلية من دفق الفيديو في الوقت الفعلي (يتم جمع بيانات الكثافة الضوئية من مناطق الاهتمام التي يحددها المستخدم [ROI] الموضوعة على صور خلايا عضلة القلب السليمة وبالتوازي مع محور الانكماش ، الشكل 2 ب). تظهر بيانات الكثافة البصرية نطاقات ساطعة ومظلمة تتوافق مع خطوط Z لخلايا عضلة القلب (الشكل 1 ، الشكل 2C). أخيرا ، يتم عرض هذه البيانات للمستخدم لأغراض المراقبة وحفظها على قرص لتحليلها لاحقا (الشكل 2C).تجنب مناطق الخلايا التي لا يتم التركيز عليها. أيضا ، لا تضع عائد الاستثمار بالقرب من حافة الخلايا ، لأن التغييرات في تقلص الخلايا أثناء تطبيق الأدوية يمكن أن تتسبب في عدم قدرة عائد الاستثمار على قراءة تقلص الخلايا. عند اكتمال اختيار عائد الاستثمار وتفي الانقباضات بالمعايير اللازمة للاستخدام (على سبيل المثال ، تقصير القطعة العضلية >1٪ ؛ الانكماش الإيقاعي عند تطبيق تردد سرعة 1 هرتز ، غياب أحداث عدم انتظام ضربات القلب) ، ابدأ التجربة لتقييم آثار المركب. يوضح الجدول 1 بروتوكول التحفيز وتسلسل تطبيق المركب لتركيزات الاختبار. وسيدير برنامج الاقتناء، بطريقة آلية، الحصول على البيانات وعرضها ووضع العلامات على تركيزات الاختبار ووقت المعالجة.ملاحظة: قم بتطبيق تركيزات الاختبار إذا ظل الانكماش عند سعة ثابتة طوال فترة خط الأساس للمركبة. استبعاد الخلايا التي تعرض إما تشغيلا أو متهدما. تأكد أيضا من تحويل التروية إلى تركيزات الاختبار المختلفة طوال التجربة. عند الانتهاء من التجربة وتخزين البيانات على الخادم ، قم بإيقاف تشغيل التروية والسخان ، وإيقاف التحفيز ، وتنظيف غرفة المجهر بالماء المقطر ، ثم إزالة الغطاء الزجاجي ، وتجفيف الغرفة جيدا.ملاحظة: نظف الحجرة جيدا لأن هذا أمر بالغ الأهمية لتجنب تعريض المجموعة التالية من الخلايا لأي مركب قبل الأوان ، وبالتالي إبطال أي بيانات تم جمعها. بعد ذلك ، قم بإجراء طلاء جديد لخلايا عضلة القلب وقم بإجراء تجربة إضافية للحصول على بيانات كافية لإكمال اختبار المركب أو اختبار مركب جديد. 8. إيقاف تشغيل نظام تسجيل الانقباض البصري عند اكتمال الاختبار اليومي للمركب (المركبات) ، قم أولا بإيقاف تشغيل جميع المعدات غير الضرورية لتنظيف النظام ونسخ البيانات لتحليلها في وضع عدم الاتصال. بعد ذلك ، قم بإزالة الزجاجات سعة 100 مل (جدول المواد) التي تحتوي على محاليل تركيزات الاختبار النهائية واستبدلها بزجاجات زجاجية مملوءة في منتصف الطريق بمحلول مركز RBS 25 (جدول المواد). قم بلف محلول RBS من خلال غرفة المجهر لمدة 5 دقائق ، ثم افصل أنبوب التروية عن الغرفة ، وقم بتنظيفه بالماء المقطر ، وأخيرا جففه جيدا.ملاحظة: تأكد من أن الفراغ يعمل بشكل جيد لمنع أي فيضان محتمل. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب التروية بأنبوب الصرف. باستخدام برنامج نظام التروية المدفوع بالضغط (جدول المواد) ، قم بتشغيل حل RBS لمدة 10 دقائق مع ضمان ضبط الضغط ومعدل التدفق بشكل مناسب. بعد ذلك ، قم برش 1٪ DMSO لمدة 5 دقائق ثم قم بتقطير الماء لمدة 15-20 دقيقة لإكمال تنظيف نظام التروية. أطفئ ضوء المجهر وضع غطاءه. ثم افصل أسلاك الكاميرا من الصندوق الموجود على جانب المجهر وأوقف تشغيل المروحة. تأكد من إرسال جميع الزجاجات المستخدمة للتنظيف والأوتوكلاف. أخيرا ، تأكد من امتلاء جميع دلاء الصرف بمقدار 1/4 أو أقل.ملاحظة: تأكد من وجود ما يكفي من أغطية الغلاف المطلية باللامينين للاستخدام في اليوم التالي. أخيرا ، انسخ الملفات الموجودة في مجلد الاستحواذ لجميع التجارب التي أجريت على كل نظام تسجيل والصقها في خادم نسخ احتياطي آمن لإجراء تحليل إضافي في وضع عدم الاتصال. بعد ذلك ، احذف جميع ملفات البيانات من مجلد الاستحواذ. 9. تحليل بيانات الانقباض قم بإجراء تحليل دون اتصال باستخدام برنامج التحليل وماكرو مخصص لمتوسط البيانات. يقوم برنامج التحليل بحساب والإبلاغ عن مقاييس مختلفة من بيانات ديناميكيات القطعة العضلية التي ينتجها برنامج الاستحواذ. يتم توفير قائمة مفصلة بهذه المعلمات في الشكل 2D.ملاحظة: يسمح تطبيق تقنيات البرامج منخفضة المستوى بتحليل العديد من عمليات تشغيل التسجيلات في 5 ثوان. المعلمة الرئيسية لتقييم التغيرات التي يسببها الدواء في الانقباض هي سعة الانقباض (تقصير القطعة العضلية ٪ = التغير في طول القطعة العضلية). يتم حسابه على أنه طول القطعة العضلية عند ذروة الانكماش / طول القطعة العضلية أثناء الراحة ومتوسطها على آخر 20 عابرا للانقباض لكل تركيز اختبار. حدد التأثيرات المركبة للاختبار على متوسط سعة الانقباض بالنسبة لحالة التحكم في السيارة الأساسية المحددة لكل خلية عضلية قلبية. عبر عن متوسط النتائج كمتوسط ± SEM وأنتج رسما بيانيا يرسم تأثير تركيز مركب الاختبار على سعة الانقباض. بعد ذلك ، قم بملاءمة منحنى التركيز والاستجابة لمعادلة هيل باستخدام برنامج التحليل (جدول المواد) لاشتقاق قيم IC50 (التركيز الذي ينتج تثبيطا بنسبة 50٪ لسعة الانقباض) وقيم EC50 (التركيز الذي ينتج عنه زيادة بنسبة 50٪ في سعة الانقباض). بالإضافة إلى سعة الانقباض ، يمكنك أيضا حساب المعلمات الأخرى:الانقباض اللاحق: حدد الانقباض اللاحق على أنه انكماش ثانوي عفوي عابر للخلية العضلية القلبية يحدث قبل الانقباض العادي التالي وينتج عنه تقلص غير طبيعي وغير متزامن. فشل الانكماش: حدد فشل الانكماش على أنه عدم قدرة التحفيز الكهربائي على إحداث انكماش. التباين قصير المدى (STV) والبديلات: تصور هاتين المعلمتين في مخططات بوانكاريه لتقلب سعة الانكماش.احسب STV (∑|جرقم + ١ − ج| (20 × √2) −1) مع آخر 20 عابرا لكل فترة تركيز مقالة تحكم واختبار. حدد المولدات على أنها عابرة متكررة متناوبة قصيرة وطويلة السعة الانقباضية. لحساب حدوث عدم انتظام ضربات القلب ، قم بتطبيع قيم STV لقيمة التحكم في السيارة لكل خلية ، ورسم الانكماش اللاحق ، وفشل الانكماش ، و STV ، والمولدات ، والتعبير عنها كنسبة مئوية من حدوث الخلايا التي تظهر كل إشارة. أكمل التنميط الميكانيكي متعدد المعلمات بحساب الوقت ذروة Ato ، والاضمحلال إلى استرخاء 30٪ (الاضمحلال 30) ، والاضمحلال إلى استرخاء 90٪ (الاضمحلال 90) ، والوقت حتى الاسترخاء بنسبة 90٪ (TR90) (الشكل 2D) ، وطول القطعة العضلية الأساسية ، والوقت حتى ذروة 50٪ ، وارتفاع الذروة ، وطول القطعة العضلية عند انقباض الذروة ، وسرعة الانكماش القصوى ، وسرعة الاسترخاء القصوى12. مثل سعة الانقباض ، عبر عن هذه المعلمات بالنسبة إلى حالة التحكم الأساسية المحددة لكل خلية عضلية قلبية ورسمها بيانيا في مخططات التركيز والاستجابة.