고립된 성인 인간 원발성 심근세포의 심장 수축성 측정

모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 연구에 사용된 모든 인간의 심장은 이식이 불가능했으며 미국에 있는 사체 장기 기증자로부터 정보에 입각한 법적 동의(1인 또는 친척)에 의해 윤리적으로 획득되었습니다. 회수 프로토콜과 체외 실험은 미국 장기 조달 이식 네트워크(OPTN) 내 이식 센터의 IRB(Institutional Review Boards)에서 사전 승인되었습니다. 또한, 기증자의 심장에 대한 모든 이송은 완전히 추적이 가능하며 미국 연방 당국에 의해 주기적으로 검토됩니다. 알림: 적절한 개인 보호 장비(예: 실험실 가운, 보안경, 장갑) 착용을 포함하여 이 프로토콜을 실행하는 동안 필요한 모든 안전 절차를 적용하십시오. 1. 심근세포 분리(수축성 측정 1일 전) 실험실에 도착하자마자 얼음처럼 차가운 독점적인 심마비 용액6으로 기증자의 심장을 재관류하고 심실에서 효소적으로 성인 인간 일차 근세포를 분리한다 11,12,13,14,15. 그런 다음, 심근세포를 현탁액으로 유지하고 10mL의 용액 A(110mM 자당, 0.005mM CaCl2, 3mMMgCl2, 70mM KOH, 60mM 락토바이오닉산, 10mM KH2PO4, 20mM 타우린, 20mML-히스티딘, 20mM HEPES, 2mM L-글루탐산, 2mM L-(-)-말산, pH 7.4 with KOH)를 20mL Wheaton 바이알(재료 표)에 담아 냉장 온도에서 실험적으로 조사할 때까지 보관합니다.참고: 바이알당 200,000개의 세포를 보관하십시오. 2. 라미닌 코팅 준비(수축성 측정 1일 전) 단일 유리 커버슬립(25mm x 25mm 정사각형, 재료 표)을 8웰 배양 플레이트(재료 표)의 각 웰에 놓습니다. 그런 다음 커버슬립을 5μg/mL 농도의 라미닌으로 코팅합니다. 이렇게하려면 800 μL의 인간 재조합 라미닌 521 스톡 (재료 표, -20 ° C에서 보관)을 용액 B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM 포도당 및 10 mM HEPES, pH 7.4 NaOH)에 넣고 잘 혼합합니다. 희석된 라미닌 용액 200μL를 각 커버슬립의 중앙에 떨어뜨립니다. 그런 다음 접시를 덮고 4°C 냉장고에 쌓습니다.알림: 라미닌 코팅된 커버슬립이 충분한지 확인하기 위해 여러 개의 8웰 배양 플레이트를 준비합니다. 3. Ca2+-내성 심근세포의 제조(수축성 측정 당일) 냉장고에서 세포 바이알을 꺼내고 바이알에서 용액 A를 흡인하고 냉장 보관된 용액 B 10mL를 추가합니다.알림: 셀이 흡입되지 않았는지 확인하고 바이알 벽 상단 안쪽에 피펫을 놓아 용액 B를 바이알에 분산시킵니다. 세포의 바이알을 덮고 부드럽게 소용돌이쳐 세포가 용액 B 전체에 분산되도록 합니다. 마지막으로 세포를 실온(RT)에서 1시간 동안 가라앉힙니다. 4. 기록 시스템 준비 (수축성 측정 당일) 참고: 기록 시스템에는 온도 제어 상자, 자극기, 컴퓨터 제어 압력 구동 관류, 압력 구동 관류 병, 관심 영역(ROI) 선택 및 수축 과도 상태 표시를 허용하는 사내 획득 소프트웨어, 도립 현미경, 셀 챔버 및 카메라가 포함됩니다(그림 1). 흡입 진공 시스템을 켭니다. 그런 다음 현미경 커버를 제거하고 전원을 켠 다음 카메라를 연결하고(재료 표, 그림 1) 마지막으로 팬이 켜져 있는지 확인하여 카메라가 과열되지 않도록 합니다. 그런 다음 현미경 가열판(재료 표)과 온도 조절 상자(재료 표, 그림 1)를 켜고 적절한 작동 온도로 설정합니다. 그런 다음 자기계 자극기(재료 표, 그림 1)와 압력 시스템을 켭니다. 마지막으로 용액의 튜브(재료 표)를 기록 챔버(재료 표, 그림 1)에 연결합니다. 5. 시험 화합물의 준비(수축성 측정 당일) 묽은 디메틸설폭사이드(DMSO; 재료 목차) 용액 C(145mM NaCl, 4mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1mMMgCl2, 11.1mM 포도당 및 10mM HEPES, NaOH가 있는 pH 7.4)를 1,000배 넣어 0.1% DMSO 비히클 용액을 만듭니다. 0.001μM의 치료 노출의 1배, 10배, 100배 및 1000배에서 화합물을 테스트하려면 테스트 화합물을 1mM 농도로 DMSO에 용해시킵니다. 이 용액을 DMSO로 연속적으로 희석하여 3개의 추가 DMSO 스톡(예: 0.001mM, 0.01mM 및 0.1mM)을 생성합니다. 마지막으로 각 테스트 화합물 스톡을 100mL의 용액 C에 1,000배 희석하여 최종 테스트 농도(0.001μM, 0.01μM, 0.1μM 및 1μM)를 얻습니다. 차량 용액과 화합물의 최종 마이크로몰 농도 용액을 100mL 유리병에 추가한 다음(재료 표, 그림 1) 병을 압력 구동 관류 시스템에 연결합니다(재료 표, 그림 1). 그런 다음 200-300mbar의 압력을 사용하여 컴퓨터 기반 프로그램(재료 표)으로 관류 시스템을 프라이밍하여 1.8mL/분의 속도로 일정한 관류 흐름을 제공합니다.알림: 테스트 화합물이 용해도 문제와 관련이 있는 것으로 판명되면 실험을 수행하지 마십시오. 또한 세포에 실험적으로 적용하기 전 30분 이내에 원액에서 화합물 테스트 용액을 제형화합니다. 6. 심근세포의 도금(수축성 측정 당일) 라미닌 코팅된 커버슬립이 들어 있는 8웰 플레이트를 4°C 냉장고에서 꺼내 커버슬립 하나를 매우 잘 청소된 기록 챔버에 조심스럽게 넣습니다(그림 1). 그런 다음 다음 플레이팅이 될 때까지 8웰 플레이트를 4°C 냉장고에 다시 넣습니다.알림: 보푸라기가 없는 물티슈(재료 표)를 사용하여 얇은 라미닌 층으로 코팅된 커버슬립을 유지하면서 코팅된 커버슬립을 닦습니다. 또한 사용한 커버슬립은 날카로운 물건 용기에 버리십시오. 그런 다음 세포의 에스컬레이션된 바이알(3.2단계)을 가져와서 바이알에서 용액 B를 흡인하여 세포를 잃지 않고 가능한 한 작은 부피(~200μL)에 도달합니다. 다음으로, 200μL의 세포를 도립 현미경의 스테이지에 장착된 기록 현미경 챔버에 분주합니다(재료 표). 세포가 커버슬립에 5분 동안 가라앉도록 합니다. 세포가 완전히 가라앉을 때까지 기다리는 동안 현미경의 시야를 열고 세포 밀도가 실험 실행을 시작하기에 적절한지(~70%) 확인합니다.알림: 200μL 이상이 분주되는 경우 흡입이 모든 세포를 흡인하지 않도록 하십시오. 7. 심근세포 수축율의 기록 도금이 완료된 후 압력 구동 관류 시스템을 사용하여 용액 C로 세포를 연속적으로 관류하여 5분 동안 세포를 평형화합니다(재료 표). 흡입을 올바르게 조정하고 온도 조절 상자와 가열판을 모두 켠 다음 ~35°C를 전달하도록 설정합니다. 그런 다음 전계 자극기에 연결된 챔버의 반대쪽에 배치된 한 쌍의 백금 와이어를 사용하여 전계 자극기에서 1Hz 페이싱 주파수(3ms 지속 시간의 양극성 펄스)에서 초임계 전압으로 세포를 자극합니다. 자극 펄스의 진폭을 1V로 설정한 다음 심근세포가 수축-이완 주기를 생성하기 시작할 때까지 진폭을 늘립니다. 실험 전체에서 임계값 1.5배 값을 사용합니다.참고: 막대 모양의 형태와 명확한 줄무늬가 있는 건강한 세포를 선택하십시오. 그런 다음 시야를 조정하고 가능한 한 많은 수축 세포를 시야에 가져오는 데 집중합니다(그림 2A). 다음으로, 광학 수축성 기록 시스템의 수집 소프트웨어 내에서 세포의 디지털화된 이미지를 표시합니다. 이 소프트웨어는 150FPS(Table of Materials, 그림 1)의 고해상도, 하이 프레임 레이트 카메라를 사용하여 동일한 프레임에 여러 개의 근세포가 포함된 비디오 스트림을 녹화합니다.참고: 이것은 여러 건강한 근세포의 육종 역학을 동시에 포착하고 측정할 수 있는 충분한 시간적, 공간적 해상도를 제공합니다. 코어 수가 많은 최신 프로세서를 활용하여 비디오 스트림에서 육종 길이의 변화를 실시간으로 병렬로 계산할 수 있습니다(광학 밀도 데이터는 건강한 심근세포의 이미지 위에 배치되고 수축 축과 평행하게 배치된 사용자 정의 관심 영역(ROI)에서 수집됩니다( 그림 2B). 광학 강도 데이터는 심근세포의 Z-라인에 해당하는 밝은 밴드와 어두운 밴드를 보여줍니다(그림 1, 그림 2C). 마지막으로, 이러한 데이터는 모니터링 목적으로 사용자에게 표시되고 나중에 분석할 수 있도록 디스크에 저장됩니다(그림 2C).초점이 맞지 않는 세포 영역을 피하십시오. 또한 약물 적용 중 세포 수축의 변화로 인해 ROI가 세포의 수축을 읽을 수 없게 될 수 있으므로 ROI를 세포의 가장자리 가까이에 배치하지 마십시오. ROI 선택이 완료되고 수축이 사용에 필요한 표준(예: 육종 단축 >1%, 1Hz 페이싱 주파수 적용 시 리드미컬 수축, 부정맥 사건 없음)을 충족하면 화합물의 효과를 평가하기 위한 실험을 시작합니다. 자극 프로토콜 및 화합물의 시험 농도 적용 순서는 표 1에 나와 있습니다. 수집 소프트웨어는 자동화된 방식으로 데이터 수집 및 표시와 테스트 농도 및 처리 시간의 라벨링을 관리합니다.알림: 수축이 기준선 차량 기간 전체에 걸쳐 안정적인 진폭으로 유지되는 경우 테스트 농도를 적용하십시오. 런업 또는 런다운을 표시하는 셀을 부적합 처리합니다. 또한 실험 전반에 걸쳐 관류가 다른 테스트 농도로 전환되었는지 확인하십시오. 실험이 완료되고 서버에 데이터 저장이 완료되면 관류와 히터를 끄고 자극을 중지하고 현미경 챔버를 증류수로 청소한 다음 유리 커버슬립을 제거하고 챔버를 완전히 건조시킵니다.알림: 챔버를 철저히 청소하는 것은 다음 세포 세트가 화합물에 조기에 노출되어 수집된 모든 데이터가 무효화되는 것을 방지하는 데 중요하므로 중요합니다. 다음으로, 심근세포의 새로운 도금을 수행하고 추가 실험을 수행하여 화합물의 테스트를 완료하거나 새로운 화합물을 테스트하기에 충분한 데이터를 얻습니다. 8. 광학 수축성 기록 시스템 끄기 화합물의 일일 테스트가 완료되면 먼저 시스템을 청소하는 데 필요하지 않은 모든 장비의 전원을 끄고 오프라인 분석을 위해 데이터를 복사합니다. 다음으로, 최종 테스트 농도의 용액이 들어 있는 100mL 유리병(재료 표)을 제거하고 RBS 25 농축액(재료 표)으로 반쯤 채워진 유리병으로 교체합니다. 현미경 챔버를 통해 RBS 용액을 5분 동안 관류한 다음 챔버에서 관류 튜브를 분리하고 증류수로 세척한 다음 마지막으로 완전히 건조시킵니다.알림: 가능한 범람을 방지하기 위해 진공 청소기가 제대로 작동하는지 확인하십시오. 다음으로 관류 튜브를 배수 튜브에 연결합니다. 압력 구동 관류 시스템(재료 표)의 소프트웨어를 사용하여 압력과 유량이 적절하게 설정되었는지 확인하면서 RBS 솔루션을 10분 동안 실행합니다. 그런 다음 1% DMSO를 5분 동안 관류한 다음 증류수를 15-20분 동안 관류하여 관류 시스템 세척을 완료합니다. 현미경 조명을 끄고 덮개를 씌웁니다. 그런 다음 현미경 측면의 상자에서 카메라 와이어를 뽑고 팬을 끕니다. 사용한 모든 병은 세척 및 오토클레이브를 위해 보내졌는지 확인하십시오. 마지막으로 모든 배수 버킷이 1/4 이하인지 확인하십시오.알림: 다음 날 사용할 수 있는 라미닌 코팅 커버슬립이 충분한지 확인하십시오. 마지막으로, 각 기록 시스템에서 수행된 모든 실험의 수집 폴더에 있는 파일을 복사하고 추가 오프라인 분석을 위해 안전한 백업 서버에 붙여넣습니다. 그런 다음 수집 폴더에서 모든 데이터 파일을 삭제합니다. 9. 수축성 데이터 분석 분석 소프트웨어와 맞춤형 매크로를 사용하여 오프라인 분석을 수행하여 데이터의 평균을 구합니다. 분석 소프트웨어는 수집 소프트웨어에서 생성된 육종 역학 데이터에서 다양한 메트릭을 계산하고 보고합니다. 이러한 매개변수의 자세한 목록은 그림 2D에 나와 있습니다.알림: 저수준 소프트웨어 기술을 적용하면 5초 안에 많은 녹음 실행을 분석할 수 있습니다. 약물에 의한 수축성 변화를 평가하기 위한 주요 매개변수는 수축성 진폭(sarcomere shortening % = sarcomere length의 변화)입니다. 이는 최대 수축/휴지 육종 길이에서의 육종 길이로 계산되며 각 시험 농도에 대해 지난 20회 수축성 과도 현상에 대한 평균입니다. 각 심근세포의 특정 기준 차량 제어 조건에 대한 평균 수축성 진폭에 대한 테스트 화합물 효과를 정량화합니다. 평균 결과를 평균 ± SEM으로 표현하고 수축성 진폭에 대한 테스트 화합물의 농도 효과를 플로팅하는 그래프를 생성합니다. 다음으로, 분석 소프트웨어(재료 목차)를 사용하여 농도-반응 곡선을 Hill 방정식에 피팅하여 IC50(수축성 진폭을 50% 억제하는 농도) 및 EC50(수축성 진폭을 50% 증가시키는 농도) 값을 도출합니다. 수축성 진폭 외에도 다른 매개변수를 계산할 수도 있습니다.수축 후: 수축 후를 다음 정기 수축 전에 발생하고 비정상적이고 동기화되지 않은 수축을 일으키는 심근세포의 일시적인 자발적인 이차 수축으로 식별합니다. 수축 실패: 수축 실패를 전기 자극이 수축을 유도할 수 없는 것으로 식별합니다. 단기 변동성(STV) 및 교류: 수축 진폭 변동성에 대한 푸앵카레 플롯에서 이 두 매개변수를 시각화합니다.STV 계산(∑|CAn + 1 − CAn| (20× √2) −1) 각 제어 및 테스트 항목 집중 기간의 마지막 20 과도 현상으로. alternans를 반복적인 교대 짧고 긴 수축성 진폭 과도 현상으로 식별합니다. 부정맥 유발률을 계산하려면 STV 값을 각 세포의 차량 제어 값으로 정규화하고, 수축 후, 수축 실패, STV 및 교류를 플로팅하고, 이를 각 신호를 나타내는 세포의 발생률(%)로 표현합니다. 시간 Ato 피크, 30% 완화까지의 감쇠(Decay 30), 90% 완화까지의 감쇠(Decay 90), 90% 완화까지의 시간(TR90)(그림 2D), 기준선 sarcomere 길이, 50% peak까지의 시간, peak height, peak contractibility에서의 sarcomere 길이, 최대 수축 속도 및 최대 완화 속도12를 계산하여 다중 모수 기계 프로파일링을 완료합니다. 수축성 진폭과 마찬가지로 각 심근세포의 특정 기준선 제어 조건을 기준으로 이러한 매개변수를 표현하고 농도-반응 플롯으로 그래프로 표시합니다.