فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي للفئران لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD). يعتمد CHS على التحسس باستخدام hapten التفاعلي عن طريق طلاء الجلد الحليق للصدر والبطن ، مع تحدي جلد الأذن اللاحق باستخدام هابتن مخفف ، مما يسبب رد فعل تورم يتم تقييمه بطرق مختلفة.
فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي لالتهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) يمكن دراسته على الفئران. تهدف هذه الدراسة إلى تقديم طريقة مختبرية موضوعية قد تساعد في دراسة تفاعل CHS في الفئران ، والتي يمكن قياسها وتحديدها كميا من خلال اختبارات مختلفة. وللحث على CHS، في اليوم “0”، تم تحسس الفئران على بقعة كانت محلوقة سابقا عن طريق طلاء جلد البطن باستخدام الهابتن 2،4،6-trinitrochlorobenzene (TNCB) في خليط الأسيتون والإيثانول، في حين تم تحسس الفئران ذات التحكم السلبي بخليط الأسيتون والإيثانول وحده في السيارة. في اليوم “4” ، تم قياس سمك الأذن الأساسي بميكرومتر قبل استنباط CHS (التحدي) عن طريق طلاء كلتا الأذنين ب TNCB المخفف في كل من مجموعات الاختبار والتحكم. بعد 24 ساعة ، تم قياس تورم الأذن باستخدام ميكرومتر. CHS هو مثال على الاستجابة المناعية بوساطة الخلايا التائية التي تسبب تورما في الأنسجة الملتهبة ، وتبلغ ذروتها بعد 24 ساعة من تحدي الجلد بنفس الهابتن. ارتبطت الزيادة في وذمة الأذن بزيادة وزن الأذن ، ونشاط الميلوبيروكسيديز (MPO) ، وتركيز السيتوكين المؤيد للالتهابات في مستخلصات الأذن ، وزيادة سماكة الأدمة الوذمية في الفحص النسيجي ، ونفاذية الأوعية الدموية في الأذن. كانت هناك أيضا زيادة في تركيز الأجسام المضادة IgG1 الخاصة ب TNP في مصال مجموعة الاختبار عند مقارنتها بالفئران الضابطة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن نقل هذه المواد بنجاح باستخدام الخلايا المستجيبة ل CHS التي تم الحصول عليها من الجهات المانحة التي سبق توعيتها باستخدام TNCB. تم إعطاء الخلايا المستجيبة ل CHS عن طريق الوريد في الفئران المتلقية الساذجة ، والتي تم تحديها لاحقا بنفس الهابتن المخفف. تم قياس تورم الأذن مع ميكرومتر 24 ساعة في وقت لاحق.
التهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) هو مرض التهابي جلدي شائع في البلدان الصناعية ناجم عن تفاعل فرط الحساسية من النوع الرابع الناتج عن التعرض لمواد كيميائية منخفضة الوزن الجزيئي تسمى haptens. تشمل المواد المسببة للتحسس التماسي لدى البشر أيونات المعادن الثقيلة (الكروم والنيكل والحديد والكوبالت) وزيت التربنتين والعطور والأصباغ والمواد الحافظة الموجودة في مستحضرات التجميل (على سبيل المثال ، p-phenylenediamine) ، وبعض الأدوية (مثل النيومايسين والبنزوكايين) والمضادات الحيوية β-lactam (أي البنسلين) والمواد الكيميائية التي تنتجها النباتات (pentadecacatechol ، وهي مادة موجودة في اللبلاب السام) ، وكذلك الهيدروكينون المستخدم في صناعة التصوير الفوتوغرافي 1,2 . العوامل المسببة ل ACD عالية جدا حيث يتم استخدام أكثر من 100000 مادة كيميائية في الصناعة وحدها ، ويتم تصنيع 2000 مادة كيميائية جديدة كل عام. حتى الآن ، تم تحديد أكثر من 3700 جزيء قد يكون ملامسا للهابتنز / المواد المسببة للحساسية3. تفاعل فرط الحساسية التماسية (CHS) هو نموذج تجريبي ل ACD يمكن دراسته في الفئران والخنازير الغينية والجرذان ويمكن أن يسببه التطبيق الجلدي الموضعي للهابتنز الكيميائي التفاعلي المذاب في المذيبات العضوية 4,5,6. تهدف هذه الدراسة إلى وصف طريقة مختبرية موضوعية قد تساعد في دراسة تفاعل CHS في الفئران ، والتي يمكن قياسها وتحديدها كميا من خلال اختبارات مختلفة.
يتكون CHS من مراحل التوعية (الحث) والمستجيب (التحدي). في النماذج الحيوانية ، ترتبط الهابتنز أولا تساهميا بالبروتينات في الجسم لإنشاء مستضدات جديدة. خلال مرحلة التحسس، تعزز الخلايا الكيراتينية المنشطة هجرة ونضج الخلايا المتغصنة الجلدية (sDCs) عن طريق إنتاج عامل نخر السيتوكينات المؤيد للالتهابات α (TNF-α) والإنترلوكين 1β (IL-1β)7. تقدم خلايا لانجرهانز الجلدية (LCs) مستضدات خلال مراحل الحث والمستجيب CHS8. LCs المعرضة للهابتن أثناء التحسس تعزز تحريض كل من الخلايا التنظيمية والمستجيبة9. تشير الأدلة المتزايدة من العديد من الدراسات إلى أن استجابات CHS يمكن أن تتوسط فيها إما خلايا Th1 المقيدة من الفئة الثانية CD4 + MHC ، والتي تطلق محليا γ الإنترفيرون (IFN-γ) لاستخدام تسلل التهابي مميز ، والخلايا الليمفاوية Tc1 المقيدة من الفئة الأولى CD8 + MHC التي يمكنها أيضا إطلاق γ IFN ولكن في الغالب توسط الضرر السام للخلايا للخلايا الكيراتينية ، والآن أيضا خلايا Th17 المنتجة للإنترلوكين 17 (IL-17)10 ، 11.
تم تطوير العديد من نماذج CHS المختلفة التي تستخدم أنواعا مختلفة 1 2,13,14 و haptens (يتم تلخيص مقارنة مفصلة بين مختلف haptens والمذيبات ووقت التطبيق في الجدول 1). يقدم الفأر ، وهو نوع مختبري يستخدم بشكل متكرر ، بعض المزايا في دراسة CHS. هناك المزيد من السلالات والضربات القاضية (KO) والحيوانات المعدلة وراثيا بين الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى ، مما يجعلها حيوانا جذابا للغاية15. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب نموذج CHS العديد من الحيوانات ، والفئران أكثر اقتصادا هنا. النماذج الحيوانية لا تحاكي ACD في جميع الجوانب. على وجه الخصوص ، فإنها تظهر التقشر والتقشر ، وهو أمر غير شائع بالنسبة للبشر16,17. من الصعب إعادة إنتاج ميزات الأمراض المزمنة ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن النموذج الموصوف لا يفترض تطبيق hapten لفترة طويلة من الزمن. ومع ذلك، فقد تأكد هنا أن العديد من الجوانب الهامة لحوار التعاون الآسيوي مستنسخة. وقد تبين أيضا أنه ، كما هو الحال في البشر ، ترتبط هذه الميزات بالحساسية المحلية. تم إملاء اختيار hapten ومذيبه وتطبيقه الموضح في هذا البروتوكول من خلال حقيقة أن النتائج قد تم تأكيدها من خلال العديد من الاختبارات في المختبر وأنه تم اختبارها وتعديلها في المختبر لسنوات عديدة حتى تم إنشاء الإصدار الحالي. تسمح نماذج المورين بتحليل المجموعات الفرعية للخلايا أو السيتوكينات التي تشارك في تطوير ACD وهي ضرورية للتقييمات قبل السريرية للعلاجات الجديدة.
يتم تحفيز CHS عن طريق haptens ، والتي ترتبط بمستضدات البروتين الذاتي في الجلد ، مما يخلق مستضدات جديدة. يتم التوسط في CHS من خلال التوظيف المحلي خارج الأوعية الدموية للخلايا التائية المستجيبة ل CHS المستجيبة للمستضد ، مما يؤدي إلى تورم في الأنسجة المتحدية ، ويبلغ ذروته بعد 24 ساعة من تعرض الجل?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من خلال الإعانة SUBZ. A020.22.060 من الجامعة الطبية في فروتسواف ، بولندا ، ومن خلال منح من وزارة العلوم والتعليم العالي N N401 545940 إلى MS و IP2012 0443 72 إلى MMS.
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |