الجمع بين مجهر المقاصة والتألق لتصور التغيرات في التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية للبلازموديوفورا براسيكاي
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة محسنة للمراقبة النسيجية للكرات التي تسببها Plasmodiophora brassicae. يتم مسح أقسام Vibratome من hypocotyls قبل التصوير الفلوري لدراسة تورط عوامل النسخ والهرمونات النباتية أثناء تطور المرض. يتغلب هذا البروتوكول على قيود تضمين الراتنج ، مما يتيح في تصور النبات للبروتينات الفلورية.
Abstract
تؤدي إصابة محاصيل الكرنب بواسطة الطلائعيات المنقولة بالتربة Plasmodiophora brassicae إلى تكوين المرارة على الأعضاء تحت الأرض. يتطلب تكوين الكرات إعادة البرمجة الخلوية والتغيرات في عملية التمثيل الغذائي للنبات المصاب. هذا ضروري لإنشاء حوض فسيولوجي موجه نحو مسببات الأمراض يتم إعادة توجيه العناصر الغذائية المضيفة نحوه. من أجل فهم كامل لهذا التفاعل بين النبات والممرض والآليات التي يتم من خلالها تخريب نمو المضيف وتطوره وإعادة تشكيله ، من الضروري تتبع ومراقبة التغيرات الداخلية المصاحبة لتكوين المرارة بدقة خلوية. غالبا ما تستخدم الطرق التي تجمع بين البقع الفلورية والبروتينات الفلورية لدراسة الاستجابات التشريحية والفسيولوجية في النباتات. لسوء الحظ ، فإن الحجم الكبير للكرات وشفافيتها المنخفضة يعملان كعقبات رئيسية في إجراء عمليات رصد كاملة تحت المجهر. علاوة على ذلك ، تحد الشفافية المنخفضة من استخدام الفحص المجهري الفلوري لدراسة تطور مرض كلوبروت وتكوين المرارة. تقدم هذه المقالة طريقة محسنة لإصلاح الكرات وإزالتها لتسهيل التألق والفحص المجهري متحد البؤر لفحص الكرات المصابة ب P. brassicae. تم استخدام بروتوكول إزالة الأنسجة للمسح البصري السريع متبوعا بتقسيم الاهتزاز للكشف عن التغيرات التشريحية وتوطين التعبير الجيني مع اندماج المروج وخطوط المراسل الموسومة ببروتينات الفلورسنت. ستثبت هذه الطريقة فائدتها في دراسة الاستجابات الخلوية والفسيولوجية في التراكيب الأخرى التي يسببها مسببات الأمراض في النباتات ، مثل المخلوي الناجم عن الديدان الخيطية وعقد الجذر ، وكذلك كرات الأوراق والتشوهات التي تسببها الحشرات.
Introduction
قد تطور النباتات المصابة بمسببات الأمراض أو الحشرات هياكل غير طبيعية (تشوهات الأعضاء أو الكرات) ، والتي تسمح للغازي بتناول العناصر الغذائية والتكاثر1. هنا ، تم اتباع نهج نسيجي مرضي فعال لدراسة التغيرات التي تحدث في الكرات التي تتطور على الأجزاء الجوفية من النباتات المصابة بالطلائعيات Plasmodiophora brassicae (الشكل 1). ينشأ الخيط الثانوي المرتبط بهذا العامل الممرض من حقيقة أن جراثيم P. brassicae التي تستريح يمكن أن تحتفظ بقدرتها على غزو النباتات لسنوات عديدة. في حالة زراعة اغتصاب البذور الزيتية على نطاق واسع (Brassica napus) ، هذه مشكلة خطيرة لأن العوامل الاقتصادية تقيد دوران المحاصيل ، مما يؤدي إلى تراكم الأبواغ في التربة2. يتم تحديد مقاومة اغتصاب البذور الزيتية لمرض كلوبروت الناجم عن P. brassicae وراثيا. للأسف ، غالبا ما يتفوق العامل الممرض على المقاومة بسبب بيولوجيته والمجموعة الجينية الضيقة التي نشأ منها اغتصاب البذور الزيتية. لذلك ، أصبح من المناسب دراسة استجابات ما بعد العدوى في النباتات المضيفة وقدرتها على إبطاء تطور المرض أو منع ظهور أعراض معينة.
في مرض كلوبروت ، يتم تقييم الشدة بشكل عام بناء على تطور الكرات ودرجة تلف نظام الجذر. يعرف هذا باسم مؤشر المرض-DI3. ومع ذلك ، فإنه لا يجسد بشكل كامل التقييم الحقيقي لهذا التفاعل بين النبات والممرض. على وجه الخصوص ، لا يتناول كيفية توزيع العامل الممرض داخل الجذور وما إذا كان النبات قادرا على كبح جماح P. brassicae الحركة داخل أنسجتها. علاوة على ذلك ، ليس من السهل توقع إلى أي مدى P. brassicae يعيد برمجة تشريح الأعضاء تحت الأرض. دراسات على المصنع النموذجي Arabidopsis thaliana قد أظهرت أن P. brassicae تؤدي العدوى إلى تثبيط تكوين النسيج (كل من خطوات البدء والنضج) وتعزيز تمايز اللحاء داخل الكرات4,5. علاوة على ذلك ، في جذور و hypocotyls من النباتات المصابة ، لا تترك ذرية الخلايا الكامبية الحالة الانقسامية وتتكاثر لفترة أطول من النباتات الصحية6. تتحكم هذه العملية في الحجم النهائي للمرارة وتحدد عدد جراثيم الراحة المسببة للأمراض المنتجة داخل النبات المصاب. P. brassicae– إعادة البرمجة التنموية والأيضية والفسيولوجية المدفوعة في المضيف معقدة للغاية7; لذلك ، فإن تطبيق الأدوات التي تسمح بفحص التغييرات الداخلية داخل الكرات أمر بالغ الأهمية لتقييم هذا التفاعل بشكل صحيح. تقدم دورة حياة P. brassicae مصحوبا بإعادة برمجة استقلاب الخلية المضيفة ، والذي يمكن ملاحظته على أنه نشا أو ترسب دهني7,8. العقبة الرئيسية أمام الفحص المجهري الناجح للكرات تأتي من شفافيتها المنخفضة. ونتيجة لذلك ، فإن غالبية العينات النسيجية التي تقدم تغييرات مدفوعة بجذور الهراوات داخل الكرات تنشأ من تقنيات التثبيت (الشمع أو الراتنج) متبوعة بتقسيم الميكروتوم. تم استخدام هذه الأساليب بنجاح لتحديد نشاط المروج للعديد من الجينات النشطة في كرات clubroot4,5 أو تقنيات تلطيخ مختلفة تسهل مراقبة P. brassicae تقدم دورة الحياة9. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن مراحل التثبيت والتضمين تستغرق وقتا طويلا وتؤدي إلى غسل جزئي أو كامل للجزيئات الحيوية المهمة (مثل الدهون) ، مما يعيق بشكل كبير بعض الملاحظات. مؤخرا P. brassicae تم تصور تقدم دورة الحياة في المضيف بمساعدة التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، حيث تم تصوير ميثيل ترانسفيراز من نوع SABATH (PbBSMT) تم استخدام مسبار خاص بالجينات لتحديد تكوين الأبواغ أثناء الراحة10. البديل الجيد هو استخدام طرق أخرى قائمة على التألق حيث يمكن رؤية التألق الذاتي لبعض المكونات الخلوية ، ونشاط المناطق التنظيمية 5′- المنبع للجينات المنصهرة في علامات البروتين الفلوري ، وتراكم بروتينات معينة موسومة بالفلورسنت. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الشفافية المنخفضة للعينات ، فإن العيب الرئيسي المرتبط بهذه الكائنات هو العمل مع العينات غير الثابتة ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت الذي يمكن فيه توثيق الصور عالية الجودة. في عام 2015 ، كوريهارا وآخرون.11 تطوير كاشف المقاصة ، والذي يسمح بالحفاظ على البروتينات الفلورية ويزيد من شفافية عينات الأنسجة النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، فهو متوافق مع العديد من البقع النسيجية. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق نفس التقنية بنجاح لتصور مكونات جدار الخلية المختلفة في الأنسجة النباتية12,13. هنا ، تم استخدام هذا البروتوكول لتحليل مختلف جوانب تطوير المرارة clubroot. يبدأ سير العمل بتثبيت الكرات ، وتقسيم الاهتزاز ، وتطهير الأنسجة ، والتلوين ، والتصوير الفلوري. اعتمادا على احتياجات الفرد ، مباشرة أو بعد تلطيخ معين ، يمكن إخضاع الأقسام الناتجة للفحص تحت المجهر epifluorescence أو المجهر متحد البؤر. توفر هذه الطريقة حلا فعالا لدراسة التغيرات المحلية في التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية ، بما في ذلك توازن الهرمونات النباتية والإشارات. يمكن تتبع تطور المرض من خلال النظر في نمط توزيع الجراثيم أثناء الراحة وديناميكيات النضج. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق البروتوكول بسهولة لتصوير التغييرات المميزة داخل P. brassicae النباتات المصابة ، بما في ذلك تثبيط تكوين النسيج أو استجابات دفاع النبات المضيف المرئية على أنها تقشير موضعي في الأنماط الجينية المقاومة. تأتي الأمثلة في هذا البروتوكول من التصوير الذي تم إجراؤه على Arabidopsis thaliana نموذج; ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على أنواع المحاصيل الأخرى التي تنتمي إلى Brassicaceae أسرة. الطريقة الموضحة أدناه ستسهل الدراسات التفصيلية المستقبلية للهياكل الخلوية والتغيرات الجزيئية المصاحبة لتشكيل المرارة في P. brassicae– النباتات المصابة.
سير العمل العام للبروتوكول واضح تماما ، ويمكن بسهولة تصوير جميع مراحل تطور المرارة وتوصيفها (الشكل 2). نظرا لأن P. brassicae هو أحد مسببات الأمراض المنقولة بالتربة ، يجب إجراء جميع التجارب في الأنظمة القائمة على التربة. الممرض يفضل الظروف الحمضية. لذلك ، يجب استخدام ركائز التربة غير المعالجة بالجير. على الرغم من أن P. brassicae لا تشكل تهديدا للإنسان ، إلا أنها من مسببات الأمراض النباتية التي يمكن أن تنتشر عبر التربة والمياه. لذلك ، يجب تدمير جميع أجزاء النبات المصاب ، وكذلك التربة ، بعد التجربة عن طريق التعقيم أو عن طريق العلاج بالتبييض.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المؤكد أن تطبيق محلول المقاصة على أقسام الكرات المقطوعة بالاهتزاز يعزز القدرة على دراسة التفاعل الحيوي بين P. brassicae والنبات المضيف. على الرغم من أن بروتوكول المقاصة ينطبق حتى على أقسام اليد ، إلا أنه يعمل بشكل أفضل مع أقسام الاهتزاز. يعمل إصلاح العينات في مثبت PFA كخطوة حاسمة في البروتوكول حيث يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام قبل الشروع في التقسيم. يوفر هذا المرونة لتخزين العينات لفترة محدودة دون المساس بالتعبير عن البروتينات الفلورية والحفاظ عليها أثناء التثبيت.
النيل الأحمر (في DMSO أو الميثانول) غير متوافق مع أقسام الراتنج بسبب كرهه للماء ، الذي يذيب الراتنج ويدمر الأقسام المضمنة في الراتنج17. وبالتالي ، تثبت أقسام الاهتزاز أنها مفيدة لدراسة توزيع مسببات الأمراض ودورة حياتها داخل الكرات النامية ، حيث يمكن استخدام تلطيخ النيل الأحمر بسهولة.
حل المقاصة المستخدم في هذا البروتوكول متعدد الاستخداماتللغاية 12 ، مما يسمح باستخدام مجموعة متنوعة من بقع التألق في مجموعات مختلفة لتلطيخ الجزيئات الحيوية / مكونات جدران الخلايا المختلفة (السوبرين واللجنين والسليلوز والكيتين في التفاعلات الفطرية). من الممكن أيضا مواجهة أقسام خطوط علامة GFP الفلورية وبالتالي ربط نشاط المروج أو نمط تراكم البروتين بوجود العامل الممرض في خلايا أو مناطق معينة من المرارة. ومع ذلك، لا يمكن القضاء على التألق الذاتي الخلفي من نسيج الخشب والخلايا العملاقة المملوءة بمسببات الأمراض حتى بعد بروتوكول المقاصة. يمثل هذا قيدا على النظر إلى علامات الفلورسنت خلال المراحل اللاحقة من تكوين المرارة ، خاصة عند استخدام مجهر فوق التألق وتصوير الإشارات الضعيفة.
نظرا لانخفاض مستويات التعبير / تراكم الإشارات الفلورية ، يصعب اكتشاف عوامل النسخ ، ولكن باستخدام هذه التقنية ، من الممكن الحصول على صور مرضية لها. بشكل عام ، يؤدي الجمع بين تقسيم الاهتزاز ونهج إزالة الأنسجة إلى توسيع مجموعة أدوات الملاحظات النسيجية لأنسجة المرارة المعقدة. تسهل مرونة هذا البروتوكول عملية تثبيت الأنسجة وتقلل من الوقت اللازم لقطع وتصوير عينات الأنسجة الطازجة لمراقبة البروتينات الفلورية وأنشطة المروج. مع مزيد من التحسينات ومن خلال استخدام أصباغ الفلورسنت الأخرى الخاصة بالجزيئات الحيوية المختلفة ، ستشهد هذه الطريقة تقدما أكبر في الدراسات النسيجية وتحليل الصور للأنسجة الكثيفة غير الشفافة ذات التنظيم المعقد للأنسجة. في الآونة الأخيرة ، ظهرت طريقة إزالة الأنسجة المقدمة كبروتوكول شائع ومستخدم على نطاق واسع للجمع بين وتمكين الاكتساب المتزامن لإشارات الفلورسنت المختلفة11،12،13. سيؤدي التطوير والتعديلات المستقبلية في مثل هذه التقنيات إلى تحسين دقة الصورة بشكل كبير لمراقبة تفاعلات مسببات الأمراض النباتية على المستوى الخلوي.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل المركز الوطني للعلوم في بولندا OPUS17 منحة رقم 2019/33 / B / NZ9 / 00751 “تنسيق الأوعية الدموية لمسافات طويلة في النباتات المصابة بالبلازموديوفورا براسيكاي”. نشكر البروفيسور Yrjö Helariutta (مختبر سينسبري ، جامعة كامبريدج) على مشاركة خط proHCA2::erRFP .
Materials
| 2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
| Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
| Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
| Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
| Commercial Bleach | Domestos | ||
| Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
| Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
| Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
| Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
| Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
| Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
| Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
| Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
| Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
| Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
| Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
| Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |
Referencias
- Harris, M. O., Pitzschke, A. Plants make galls to accommodate foreigners: Some are friends, most are foes. New Phytologist. 225 (5), 1852-1872 (2020).
- Peng, G., et al. Crop rotation, cultivar resistance, and fungicides/biofungicides for managing clubroot (Plasmodiophora brassicae) on canola. Canadian Journal of Plant Pathology. 36 (1), 99-112 (2014).
- Siemens, J., Nagel, M., Ludwig-Müller, J., Sacristán, M. D. The interaction of Plasmodiophora brassicae and Arabidopsis thaliana: Parameters for disease quantification and screening of mutant lines. Journal of Phytopathology. 150 (11-12), 592-605 (2002).
- Malinowski, R., Smith, J. A., Fleming, A. J., Scholes, J. D., Rolfe, S. A. Gall formation in clubroot-infected Arabidopsis results from an increase in existing meristematic activities of the host but is not essential for the completion of the pathogen life cycle. The Plant Journal. 71 (2), 226-238 (2012).
- Walerowski, P., et al. Clubroot disease stimulates early steps of phloem differentiation and recruits SWEET sucrose transporters within developing galls. The Plant Cell. 30 (12), 3058-3073 (2018).
- Olszak, M., et al. Transcriptional profiling identifies critical steps of cell cycle reprogramming necessary for Plasmodiophora brassicae-driven gall formation in Arabidopsis. Plant Journal. 97 (4), 715-729 (2019).
- Malinowski, R., Truman, W., Blicharz, S. Genius architect or clever thief-How Plasmodiophora brassicae reprograms host development to establish a pathogen-oriented physiological sink. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (10), 1259-1266 (2019).
- Bi, K., et al. Integrated omics study of lipid droplets from Plasmodiophora brassicae. Scientific Reports. 6, 36965 (2016).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Badstöber, J., Gachon, C. M. M., Ludwig-Müller, J., Sandbichler, A. M., Neuhauser, S. Demystifying biotrophs: FISHing for mRNAs to decipher plant and algal pathogen-host interaction at the single cell level. Scientific Reports. 10, 14269 (2020).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Sexauer, M., Shen, D., Schön, M., Andersen, T. G., Markmann, K. Visualizing polymeric components that define distinct root barriers across plant lineages. Development. 148 (23), (2021).
- Fuchs, H., Sacristan, M. Identification of a gene in Arabidopsis thaliana controlling resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) and characterization of the resistance response. Molecular Plant-Microbe Interactions. 9 (2), 91-97 (1996).
- Guo, Y., Qin, G., Gu, H., Qu, L. -JDof56HCA2, a Dof transcription factor gene, regulates interfascicular cambium formation and vascular tissue development in Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (11), 3518-3534 (2009).
- Liu, J., Müller, B., Kleine-Vehn, J., Sauer, M. Imaging TCSn::GFP, a Synthetic Cytokinin Reporter, in Arabidopsis thaliana. Plant Hormones: Methods and Protocols. , 81-90 (2017).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Fujimoto, T., Taatjes, D. J., Roth, J. Histochemical Detection of Lipid Droplets in Cultured Cells. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. , 483-491 (2013).
