Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina
Summary
Uma nanopartícula de peptídeo-poloxamina auto-montada (PP-sNp) é desenvolvida usando um dispositivo de mistura microfluida para encapsular e fornecer RNA de mensageiro transcrito in vitro . O mRNA/PP-sNp descrito poderia transfetar eficientemente células cultivadas in vitro.
Abstract
As vacinas de RNA (mRNA) in vitro transcritas têm mostrado enorme potencial no combate à doença coronavírus 2019 (COVID-19). Sistemas de entrega eficientes e seguros devem ser incluídos nas vacinas mRNA devido às frágeis propriedades do mRNA. Um sistema de entrega de genes auto-montado peptídeo-poloxamina (PP-sNp) foi projetado especificamente para a entrega pulmonar de ácidos nucleicos e exibe capacidades promissoras na mediação da transfecção bem sucedida do mRNA. Aqui, um método aprimorado para preparar o PP-sNp é descrito para elaborar sobre como o PP-sNp encapsula o mRNA Metridia luciferase (MetLuc) e transfes com sucesso células cultivadas. MetLuc-mRNA é obtido por um processo de transcrição in vitro de um modelo de DNA linear. Um PP-sNp é produzido misturando peptídeo sintético/poloxamina com solução mRNA usando um misturador microfluido, permitindo a auto-montagem de PP-sNp. A carga de PP-sNp é posteriormente avaliada medindo o potencial zeta. Enquanto isso, a polidispersidade e o tamanho hidrodinâmico das nanopartículas PP-sNp são medidos usando dispersão dinâmica de luz. As nanopartículas mRNA/PP-sNp são transfectadas em células cultivadas, e os supernacantes da cultura celular são testados para a atividade da luciferase. Os resultados representativos demonstram sua capacidade de transfecção in vitro. Este protocolo pode lançar luz sobre o desenvolvimento de sistemas de entrega de vacinas mRNA de próxima geração.
Introduction
A vacinação tem sido anunciada como uma das intervenções médicas mais eficientes para a redução da morbidade e mortalidade causadas por doenças infecciosas1. A importância das vacinas vem sendo demonstrada desde o surto da doença coronavírus 2019 (COVID-19). Ao contrário do conceito tradicional de injetar patógenos inativados ou atenuados vivos, abordagens de vacinas de última geração, como vacinas à base de ácido nucleico, concentram-se na preservação das propriedades imuno-estimulantes dos patógenos alvo, evitando os potenciais problemas de segurança associados ao vírus microbiano convencional ou em vacinas baseadas em bactérias. Tanto o DNA quanto o RNA (ou seja, vacinas in vitro transcritas do mensageiro, IVT mRNA) exibem profilático ao potencial terapêutico contra uma variedade de doenças, incluindo doenças infecciosas e cânceres 2,3. Em princípio, o potencial das vacinas à base de ácido nucleico diz respeito à sua produção, eficácia e segurança4. Essas vacinas podem ser fabricadas de forma livre de células para permitir uma produção econômica, escalável e rápida.
Uma única vacina à base de ácido nucleico pode codificar vários antígenos, permitindo o alvo de inúmeras variantes virais ou bactérias com um número reduzido de inoculações e fortalecendo a resposta imune contra patógenos resistentes 5,6. Além disso, vacinas à base de ácido nucleico poderiam imitar o processo natural de invasão de vírus ou infecção bacteriana, trazendo respostas imunes mediadas por células B e T. Ao contrário de algumas vacinas baseadas em DNA, as vacinas baseadas em IC mRNA oferecem uma enorme vantagem em termos de segurança. Eles podem expressar rapidamente o antígeno desejado no citosol e não estão integrados ao genoma hospedeiro, evitando preocupações sobre mutagênese insercional7. O IVT-mRNA é automaticamente degradado após a tradução bem sucedida, de modo que sua cinética de expressão proteica pode ser facilmente controlada 8,9. Catalisados pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2), os esforços de empresas/instituições em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitos tipos de vacinas. A tecnologia de vacinas baseada em IG mRNA mostra grande potencial e, pela primeira vez, demonstrou seu sucesso anteriormente antecipado, devido ao seu rápido design e capacidade flexível de se adaptar a qualquer antígeno-alvo dentro de vários meses. O sucesso das vacinas IVT mRNA contra o COVID-19 em aplicações clínicas não só abriu uma nova era de pesquisa e desenvolvimento de vacinas IVT mRNA como também acumulou experiência valiosa para o rápido desenvolvimento de vacinas eficazes para lidar com surtos de doenças infecciosas10,11.
Apesar do potencial promissor das vacinas IVT mRNA, a eficiente entrega intracelular de IVT mRNA para o local de ação (ou seja, citoplasma) continua a representar um grande obstáculo12, especialmente para aqueles administrados via vias aéreas4. IVT mRNA é inerentemente uma molécula instável com uma meia-vida extremamente curta (~7 h)13, o que torna o IVT mRNA altamente propenso à degradação pelo onipresente RNase14. Os linfócitos do sistema imunológico inato tendem a engolir o reconhecido IVT mRNA em casos de aplicação in vivo . Além disso, a alta densidade de carga negativa e o grande peso molecular (1 x 104-1 x 106 Da) de IVT mRNA prejudicam sua efetiva permeação através da bicamada lipídica aniônica das membranas celulares15. Portanto, um sistema de entrega com certos materiais biofuncionais é necessário para inibir a degradação das moléculas de mRNA IVT e facilitar a absorção celular16.
Além de alguns casos excepcionais em que o MRNA IVT nu foi diretamente utilizado para investigações in vivo, vários sistemas de entrega são usados para transportar IVT mRNA para o local terapêutico da ação17,18. Estudos anteriores revelaram que apenas alguns mRNAs IVT são detectados em citosol sem a assistência de um sistema de entrega19. Inúmeras estratégias foram desenvolvidas para melhorar a entrega de RNA com esforços contínuos no campo, desde condensação de protamina até encapsulamento lipídicos20. As nanopartículas lipídicas (LNPs) são as mais clinicamente avançadas entre os veículos de entrega de mRNA, como comprovado pelo fato de que todas as vacinas aprovadas de mRNA COVID-19 para uso clínico empregam sistemas de entrega baseados em LNP21. No entanto, os LNPs não podem mediar a transfecção eficaz do mRNA quando as formulações são entregues através da rota respiratória22, o que limita notavelmente a aplicação dessas formulações na indução de respostas imunes mucosas ou no enfrentamento de doenças relacionadas com o pulmão, como fibrose cística ou deficiência de α1-antitripsina. Portanto, é necessário desenvolver um novo sistema de entrega para facilitar a entrega eficiente e transfecção de IVT mRNA em células relacionadas às vias aéreas para resolver essa necessidade não atendida.
Foi confirmado que o sistema de entrega de nanopartículas auto-montadas de peptídeo-poloxamina (PP-sNp) pode mediar a transfecção eficiente de ácidos nucleicos no trato respiratório dos camundongos23. O PP-sNp adota uma abordagem de design modular multifuncional, que pode integrar diferentes módulos funcionais nas nanopartículas para triagem rápida e otimização23. Os peptídeos sintéticos e copolímeros de blocos anfílicos eletricamente neutros (poloxamina) dentro do PP-sNp podem interagir espontaneamente com o IVT mRNA para gerar nanopartículas distribuídas uniformemente com uma estrutura compacta e superfície lisa23. PP-sNp pode melhorar o efeito de transfecção genética de moléculas de IVT mRNA em células cultivadas e o trato respiratório de camundongos23. O presente estudo descreve um protocolo para geração de PP-sNp contendo iGM que codifica a Luciferase Metridia (MetLuc-mRNA) (Figura 1). A mistura controlada e rápida através de um dispositivo de mistura microfluida, que emprega o design de mistura de herringbone escalonado, é utilizada neste protocolo. O procedimento é fácil de executar e permite a geração de PP-sNp com tamanhos mais uniformes. O objetivo geral da produção pp-sNp usando o misturador microfluido é criar PP-sNp para a complexação de mRNA de forma bem controlada, permitindo assim transfecção celular eficiente e reprodutível in vitro. O presente protocolo descreve a preparação, montagem e caracterização do PP-sNp contendo MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito não só permite a produção econômica e rápida de formulações de vacinas IVT mRNA com propriedades definidas, mas também oferece a possibilidade de personalizar a formulação pp-sNp de acordo com propósitos terapêuticos específicos, como a terapia genética. Para garantir a geração bem sucedida de IVT mRNA/PP-sNp, sugere-se prestar atenção extra a algumas etapas críticas. Ao trabalhar com mRNA, lembre-se sempre que as condições livres de RNase devem ser mantidas durante todo o …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 e 82173764), o principal projeto de Estudo sobre Patogênese e Sistema de Tecnologia de Prevenção de Epidemias (2021YFC2302500) do Ministério da Ciência e Tecnologia da China, o Projeto De Talentos Jovens Excepcionais (CQYC202005027) e a Fundação de Ciência Natural de Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Os autores são gratos ao Dr. Xiaoyan Ding por medir o diâmetro hidrodinâmico (nm) e índice de polidispersidade (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
Referencias
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