使用肽-泊洛沙明纳米颗粒在培养细胞中高效转染 体外 转录的mRNA

疫苗接种被誉为降低传染病发病率和死亡率的最有效医疗干预措施之一¹.自2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发以来，疫苗的重要性已经得到证明。与注射灭活或减毒活病原体的传统概念相反，最先进的疫苗方法，如基于核酸的疫苗，侧重于保持目标病原体的免疫刺激特性，同时避免与传统的全微生物病毒或基于细菌的疫苗相关的潜在安全问题。基于DNA和RNA（即 体外 转录的信使RNA，IVT mRNA）的疫苗都表现出对多种疾病的预防治疗潜力，包括传染病和癌症^2，3。原则上，基于核酸的疫苗的潜力与其生产、功效和安全性有关⁴.这些疫苗可以以无细胞的方式生产，以实现具有成本效益，可扩展和快速的生产。

基于单一核酸的疫苗可以编码多种抗原，从而能够以较少的接种次数靶向多种病毒变异或细菌，并增强对弹性病原体的免疫反应^5，6。此外，基于核酸的疫苗可以模仿病毒或细菌感染的自然侵袭过程，带来B细胞和T细胞介导的免疫反应。与一些基于病毒或基于DNA的疫苗不同，基于IVT mRNA的疫苗在安全性方面具有巨大的优势。它们可以在细胞质基质中快速表达所需的抗原，并且不会整合到宿主基因组中，从而消除了对插入诱变⁷的担忧。IVT-mRNA在成功翻译后自动降解，因此其蛋白表达动力学可以很容易地控制^在8，9。在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的催化下，全球公司/机构的努力使许多类型的疫苗能够投放市场。基于IVT mRNA的疫苗技术显示出巨大的潜力，并且由于其快速设计和灵活的能力，可以在几个月内适应任何靶抗原，因此首次显示出其先前预期的成功。IVT mRNA疫苗抗击COVID-19的成功应用，不仅开启了IVT mRNA疫苗研发的新时代，也为快速开发应对传染病暴发的有效疫苗积累了宝贵经验^10，11.

尽管IVT mRNA疫苗具有广阔的潜力，但IVT mRNA在细胞内有效递送到作用部位（即细胞质）仍然是一个主要障碍¹²，特别是对于 通过 气道⁴施用的疫苗。IVT mRNA本质上是一种不稳定的分子，具有极短的半衰期（~7小时）¹³，这使得IVT mRNA极易被无处不在的RNase¹⁴降解。在 体内 应用的情况下，先天免疫系统的淋巴细胞倾向于吞噬公认的IVT mRNA。此外，IVT mRNA的高负电荷密度和大分子量（1 x 10^{4-10 10 6} Da）损害了其在细胞膜阴离子脂质双层中的有效渗透¹⁵。因此，需要具有某些生物官能材料的递送系统来抑制IVT mRNA分子的降解并促进细胞摄取¹⁶。

除了一些直接用于体内研究的裸IVT mRNA的特殊情况 外 ，还使用各种递送系统将IVT mRNA携带到作用^17，18的治疗位点。先前的研究表明，在没有递送系统¹⁹的帮助下，在细胞质基质中仅检测到少数IVT mRNA。通过在该领域的不断努力，已经开发了许多策略来改善RNA递送，从鱼精蛋白缩合到脂质包封²⁰。脂质纳米颗粒（LNP）是mRNA递送载体中临床上最先进的，所有经批准的临床用途mRNA COVID-19疫苗都采用基于LNP的递送系统²¹这一事实证明了这一点。然而，当制剂 通过 呼吸途径²²递送时，LNPs不能介导有效的mRNA转染，这显着限制了这些制剂在诱导粘膜免疫应答或解决肺部相关疾病（如囊性纤维化或α1-抗胰蛋白酶缺乏症）中的应用。因此，需要开发一种新型递送系统，以促进气道相关细胞中IVT mRNA的高效递送和转染，以解决这一未满足的需求。

已经证实，肽-泊洛沙明自组装纳米颗粒（PP-sNp）递送系统可以介导小鼠^{呼吸道中核酸23}的有效转染。PP-sNp采用多功能模块化设计方法，可以将不同的功能模块集成到纳米颗粒中，以便快速筛选和优化²³。PP-sNp内的合成肽和电中性两亲性嵌段共聚物（泊洛沙明）可以与IVT mRNA自发相互作用，生成结构紧凑、表面光滑均匀分布的纳米颗粒²³。PP-sNp可以提高IVT mRNA分子在培养细胞和小鼠呼吸道中的基因转染作用²³。本研究描述了一种用于生成含有IVT mRNA的PP-sNp的方案，该MRNA编码甲基化物胺酶（甲基葡糖-mRNA）（图1）。该方案 采用 交错式人字形混合设计的微流体混合装置进行受控和快速混合。该过程易于执行，并允许生成尺寸更均匀的PP-sNp。使用微流体混合器生产PP-sNp的总体目标是以良好控制的方式产生用于mRNA络合的PP-sNp，从而实现高效且可重复 的体外细胞转染。本实验方案描述了含有甲基葡聚糖-mRNA的PP-sNp的制备、组装和表征。