T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, NIH Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız. Retrovirüs üreticisi hücre kültürü ve bakım prosedürleri hakkında daha fazla ayrıntı için yayınlanmış kılavuz19’a bakın. Protokole genel bir bakış için Şekil 1’e bakın. 1. OP9-DL4 hücrelerinin kültürünün başlatılması (Gün 1) OP9-DL4 hücrelerini şişeyi tutarak ve 37 ° C’de bir su banyosunda hafifçe sallayarak hızla çözün. Kriyoprotektan ajanları uzaklaştırmak için hücreleri derhal 5 mL OP9 ortamı (MEM-alfa ortamı,% 10 FBS, 50 U / mL penisilin / streptomisin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL OP9 ortamında yeniden askıya alın. Bir T25 şişesine 5 mL OP9 ortamı yerleştirin ve yeniden askıya alınmış hücreleri bu şişeye ekleyin. 37 °C’de kültür ve% 5 CO2. 2-3 gün sonra, 1: 3’lük bir bölünme kullanarak hücreleri alt kültüre alın (hücreleri her pazartesi, çarşamba ve cuma günleri geçirin).NOT: OP9-DL4 hücrelerini birleşime ulaşmadan önce bölün. OP9-DL4 şişesi, timositlerle birlikte kültür için 6-7. günlerde ve 8-9+ günlerde% 80-90 oranında birleşmelidir. Bu nedenle, OP9-DL4 hücrelerini bölerken o günlerde kaç tane OP9-DL4 hücresine ihtiyaç duyulacağını planlamak önemlidir.Ortamı şişeden atın ve tek katmanı 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi atın, 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C’de 1-5 dakika veya hücreler şişeden çıkana kadar inkübe edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi yumruklayın.NOT: (İsteğe bağlı) Hücre ayrışmasının ilerlemesi mikroskopi ile kontrol edilebilir. Tripsini inaktive etmek için 5 mL OP9 ortamı ekleyin ve yeniden süspansiyon sırasında şişenin hücre kaplı yüzeyini durulayarak hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin ve 3 mL OP9 ortamında (1:3 bölünme için) tekrar askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mL’sini, zaten 5 mL taze OP9 ortamı içeren bir T25 şişesine yerleştirin. Kalan hücreleri dondurun/atın.OP9-DL4 hücrelerini dondurmak için, hücreleri% 90 FBS /% 10 DMSO’da, 1 mL dondurma ortamı ile bir şişe hücre oranında yeniden askıya alın. Gelecekteki gereksinimlere bağlı olarak 1 mL kriyovyallerde −80 °C’de veya sıvı azotta dondurun. Uzun süreli depolama için sıvı azotta saklayın. 2. Retrovirüs üreticisi hücre hattının kültürünün başlatılması (Gün 1) Retrovirüs üreticisi hücre hattını, şişeyi tutarak ve 37 ° C’de bir su banyosunda hafifçe sallayarak hızla çözün. Kriyoprotektan ajanı çıkarmak için hücreleri derhal 5 mL retrovirüs üreticisi hücre ortamı (RPC: DMEM,% 10 FBS) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL RPC ortamında yeniden askıya alın. Bir T25 şişesine 5 mL RPC ortamı yerleştirin ve askıya alınmış hücreleri bu şişeye ekleyin. 37 °C’de kültür ve% 5 CO2. Hücreleri her 2-3 günde bir 1:5 ila 1:8 arasında bir bölünmeyle geçirin.Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi yumruklayın ve agresif bir şekilde pipetleyerek hücreleri yeniden askıya alın.NOT: Bu hücreler, tripsin olmadan agresif pipetleme ile şişe yüzeyinden çıkarılabilir. Alternatif olarak, hücreler kolayca ayrılana ve tek hücreli bir süspansiyona kolayca pipetlenene kadar tripsin (% 0.05 tripsin / 0.53 mM EDTA) deneyin. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin ve 5 mL RPC ortamında (1:5 bölünme için) yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mL’sini, zaten 5 mL taze RPC ortamı içeren bir T25 şişesine yerleştirin. Kalan hücreleri dondurun/atın. Retrovirüs üreticisi hücreleri OP9-DL4 hücreleri için tarif edildiği şekilde dondurun (adım 1.4.4.1–1.4.4.2). 3. Retrovirüs üreticisi hücrelerin kültürüne 6 kuyucuklu plakalarda başlanması (Gün 4-5) Transfeksiyondan 18-24 saat önce retrovirüs üreticisi hücreleri, 2 mL RPC ortamında 6 kuyucuklu bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda% 70-90 akıcılıkta tohumlayın ve 37 ° C’de ve% 5 CO2’de inkübe edin.NOT: Dönüştürülecek her 2-5 × 105 ila 1 × 106 timosit için retrovirüs üreticisi hücrelerin iki kuyucuğunu transfekte edin. 4. İlgili genleri içeren retrovirüsü üretmek için retrovirüs üreten hücrelerin transfekte edilmesi (Gün 5-6) Transfeksiyondan 1 saat önce ortamı taze RPC ortamı ile değiştirin. Dupopeksiyon karışımları hazırlayın (6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğu için – gerektiğinde ölçeklendirin): 4 μg DNA’yı (2 μg yardımcı plazmid (pCL-Eco) ve 2 μg transfer plazmidini (pMIG) 250 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Yavaşça karıştırın. 10 μL transfeksiyon reaktifini, adım 4.2’den itibaren indirgenmiş serum ortamının 250 uL’si ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 5 dakikalık inkübasyondan sonra, seyreltilmiş DNA’yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin (toplam hacim = 500 μL). Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20-25 dakika inkübe edin. 500 μL DNA/transfeksiyon reaktifi karışımlarını, retrovirüs üreticisi hücreleri içeren kuyucuğa, dairesel bir hareketle hücrelerin üzerine bırakarak yavaşça ekleyin. Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın ve plakayı 37 ° C’lik bir inkübatörde 16-24 saat boyunca inkübe edin.NOT: Subkonfluent hücreler (-) transfeksiyon için en uygun olanıdır ve potansiyel olarak en yüksek viral titreyi üretirler. Retrovirüs üreticisi hücreler şişeden çok kolay bir şekilde yerinden çıktığından, bu hücreleri tutarken ani hareketlerden kaçının. 5. Retrovirüs üreticisi hücre ortamını değiştirme (Gün 6-7) Transfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra eski ortamı 2 mL taze RPC ortamı ile değiştirin. Hücreleri 20-24 saat boyunca 37 ° C’de inkübe etmeye devam edin. Transfeksiyon verimliliğini floresan mikroskobu altında değerlendirin (isteğe bağlı).NOT: Bu protokolde, GFP-pozitif hücreler ilgilenilen hücrelerdir (bkz. Şekil 2). Bu adım, bu protokolde kullanılmak üzere seçilen retrovirüs vektörüne (omurgada bir muhabir geninin bulunup bulunmadığı) bağlıdır. 6. CD4 + ve CD8 + hücrelerinin timosit hazırlanması ve tükenmesi (Gün 6-7) Timüsü 4-6 haftalık bir C57BL/6 fareden toplayın. Timus hasadı hakkında daha fazla bilgi için, Xing ve Hogquist20’ye bakın.NOT: Fareler CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapıldı. Timüsü bir Petri kabında 5 mL PBS’ye yerleştirerek bir timosit tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Steril cam slaytlar kullanarak, timusu slaytların buzlu yüzeyleri arasına yerleştirin ve timusu iki slayt arasında yuvarlayarak slaytları hafifçe ovalayın. Hücreleri toplamak için cam slaytları durulayın ve kalan timik stromal dokuyu atın.NOT: Bir timustan elde edilen tahmini verim 90 × 10 6-100 × 106 hücredir ve CD4 ve CD8 tükenmesinden sonra hücrelerin yaklaşık% 1’i kalacaktır. Daha iyi bir hücre verimi için genç farelerden timus dokusu kullanın, çünkü doğumdan sonraki ilk haftalarda fare timusunun hücreselliği hızla artar, 4-6 haftalıkken bir platoya ulaşır ve daha sonra21’i aşamalı olarak içerir. Otomatik bir kan hücresi sayacı veya herhangi bir alternatif yöntem kullanarak hücreleri sayın. Timik süspansiyonun 5 mL’sini bir hücre süzgecinden pipetleyerek timik süspansiyonu 30 μm veya 40 μm’lik bir filtreden geçirin. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve kırmızı kan hücrelerini ACK lizis tamponu ile lize edin (numune boyutuna bağlı olarak) 1 dakika boyunca tüp başına 1 mL tampon ekleyin. ACK lizis tamponunu devre dışı bırakmak için 5 mL hücre tükenme tamponu (500 mL PBS [pH 7.2], %0.5 BSA, 2 mM 0.5M EDTA, pH 8.0) ekleyin, 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj yapın ve sayım için 1-5 mL hücre tükenme tamponunda yeniden askıya alın.NOT: Tükenmeden önce buz üzerinde aşağıdakileri bir kenara koyun (tükenme öncesi): CD4 ve CD8 için boyama ve akış sitometrisi 22,23 ile analiz ederek tükenmenin verimliliğini belirlemek için saymak için 70 μL hücre süspansiyonu (seçilen sayma hücresi yöntemine bağlı olarak değişir) ve200 μL hücre süspansiyonu. Hücreleri sayın ve 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj yapın. Hücreleri 1 × 107/80 μL hücre tükenme tamponunda yeniden askıya alın. 1 × 107 hücre başına CD4 ve CD8 mikroboncuklarının her birine 10 μL ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta buzdolabında (2-8 ° C) 15 dakika inkübe edin. 2 mL tükenme tamponu ile durulayarak ve akışı atarak bir tükenme sütunu hazırlayın. 1 ×10 7 hücre başına 1-2 mL tükenme tamponu ekleyerek hücreleri adım 6.6’dan yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj yapın. Supernatan’ı çıkarın ve atın. 500 μL tükenme tamponunda 1,25 ×10 8 hücreye kadar yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın ve akışı (etiketlenmemiş hücreler) toplayın. Kolonu 2x 1 mL tamponla yıkayın ve akışı toplayın.NOT: Yalnızca sütun rezervuarı boş olduğunda yeni arabellek ekleyin. Tükenmeden sonra buz üzerinde aşağıdakileri bir kenara koyun (tükenme sonrası kontrol): CD4 ve CD8 için boyayarak ve akış sitometrisi22,23 ile analiz ederek tükenmenin verimliliğini belirlemek için saymak için 70 μL hücre süspansiyonu (seçilen sayma hücresi yöntemine bağlı olarak değişir) ve 1.000 μL hücre süspansiyonu. Tükenmeden önce toplanan 200 μL hücreyi dört FACS tüpüne bölerek tükenme verimliliği kontrollerini lekeleyin: lekesiz, CD4 tek boyalı, CD8 tek boyalı ve CD4 / CD8 çift boyalı (akış sitometri parametrelerini ayarlamak için lekesiz ve tek boyalı numuneleri kullanın). CD4 ve CD8 için boyamak için tükenmeden sonra toplanan 1.000 μL hücreyi kullanın ve tükenmeden önce toplanan çift boyalı numune ile karşılaştırın ( Şekil 3’teki tipik tükenme sonuçlarına bakınız).NOT: Akış sitometri boyama hacimlerini antikor üreticisinin önerisine göre ayarlayın (örneğin, 50 μL tamponda 1 x 106 hücre başına 1 μL anti-CD4-FITC + 0,5 μL anti-CD8-PE). 7. OP9-DL4 hücrelerinde timositlerin kültürlenmesi (Gün 6-7) 2-5 × 105 ila 1 × 106 tükenme sonrası timositleri, sitokinler içeren OP9 ortamında% 80-90 oranında birleşik OP9-DL4 hücrelerinden oluşan bir T25 şişesine yerleştirin (10 ng / mL rekombinant IL-7 ve rekombinant hFLT-3). 37 °C’de kültür ve% 5 CO2. OP9-DL4 hücrelerinde yaklaşık 24 saat büyür.NOT: Bu süre, T hücrelerini dönüştürülebilir hale getirmek için gereklidir ( Şekil 4’teki tipik sonuca bakın). Timositlerin ve OP9-DL4 hücrelerinin birlikte kültürlenmesinin bir T25 şişesini kontrol olarak kullanılmak üzere ayırın (dönüştürülmemiş). Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için transdübe edilmemiş timositler (adım 9.1) negatif bir kontrol olarak transdübe edilmemiş timositlerle birlikte boyanacaktır. Transdüse edilmemiş timositler, transgen ekspresyonunun hücre farklılaşması üzerindeki etkisini ölçmek için de kullanılabilir. Sitokin içeren ortamı 1 ay sonra atın. 8. Retrovirüsün süpernatanttan toplanması ve timositleri dönüştürmek için kullanılması (Gün 8-9) 6 delikli plakayı eğerek ve süpernatanı aspire etmek için pistonu çekerken plakanın altına 3-5 mL’lik bir şırınga yerleştirerek transfekte hücrelerden retrovirüsleri içeren süpernatantı toplayın. Ortamı 2 mL taze RPC ortamı ile değiştirin. Adım 8.9’daki ikinci transdüksiyon için hücreleri 20-24 saat boyunca 37 ° C’de inkübe etmeye devam edin. Retrovirüs süpernatantını 0,45 μm’lik bir şırınga filtresinden geçirin ve filtratı 50 mL’lik bir tüpte toplayın.NOT: Retroviral süpernatanı dondurmayın. Transdüksiyon için taze yapılmış bir virüs preparatı kullanın. Timositleri ve OP9-DL4 hücrelerini şişe yüzeyinden çıkarmak için agresif pipetleme ile OP9-DL4 kültüründen timositleri toplayın. OP9-DL4 hücrelerinin çoğunu çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 μm’lik bir hücre süzgecinden geçirin ve filtratı 50 mL’lik bir tüpte toplayın.NOT: OP9 hücreleri çok yapışkandır. Agresif pipetleme, OP9-DL4 hücrelerinin bir kısmını şişeden çıkarabilse de, bu işlem sırasında OP9-DL4 tek katmanının bozulması minimumdur ve OP9-DL4 hücreleri birincil timositlerden çok daha büyük olduğundan, çıkan OP9-DL4 hücreleri 40 μm hücre süzgeci ile filtrelenecektir. OP9-DL4 hücreleri hala% 80-90 oranında birleşikse, timositleri çıkarın ve aynı OP9-DL4 şişesinde yeniden plakalayın. Alternatif olarak, yeni bir OP9-DL4 şişesi hazırlanmalıdır. Filtrattaki timositleri 8.3. adımdan itibaren 300 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan’ı atın. 50 mL’lik tüpte, timositleri 0.5-1 mL OP9 ortamı + sitokinlerde yeniden askıya alın (bkz. adım 7.1). Virüsü içeren 1-2 mL RPC ortamı ekleyin (timosit ortamının iki katı kadar RPC ortamı). 8 μg heksametrin bromür / mL toplam hücre süspansiyonu elde etmek için heksametrin bromür (10 μg / μL stok konsantrasyonu) ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 850 × g’da santrifüj ederek spinülatın. Hücreleri şişe başına 6 mL OP9 ortamı + sitokinlerde yeniden askıya alın (bkz. adım 7.1) ve süspansiyonu OP9-DL4 hücre tek katmanına geri ekleyin.NOT: Alternatif olarak, dönüştürülmüş timositleri almaya hazır yeni OP9-DL4 şişeleri bulundurun. Timositler kullanılmış bir OP9-DL4 şişesine geri yerleştirilecekse, hücreleri sağlıklı tutmak ve% 80-90 akıcılık sağlamak için 1 saatlik timosit spinokülasyonu sırasında OP9-DL4 hücrelerine taze OP9 ortamı eklediğinizden emin olun. Gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Retrovirüs içeren hücre süpernatanının yeni bir kuyusunu kullanarak 8.2-8.7 arasındaki adımları tekrarlayın. 9. OP9-DL4 kültüründe transdüne timositlerin 2-5 gün boyunca muhafaza edilmesi veya gerektiğinde dondurulması (Gün 9+) CD4, CD8, CD25 ve CD4423 gibi T hücre gelişim belirteçleri için timositleri boyayarak akış sitometrisi ile timosit farklılaşmasını değerlendirin. Tipik timosit farklılaşma sonuçlarına Şekil 5’te bakınız.