조직을 통한 X선 여기 발광 화학 이미징을 통한 임플란트 관련 감염의 높은 공간 분해능 화학 이미징
Summary
여기에서는 X선 여기 발광 화학 이미징(XELCI)을 사용하여 이식된 의료 기기 주변의 화학 정보를 고분해능 광학 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 이미징 기술은 임플란트 관련 감염 생화학을 연구할 수 있는 실험실에서 개발되었습니다.
Abstract
이식형 의료 기기와 관련된 미생물 감염은 골절 고정 실패의 주요 관심사입니다. 이러한 감염의 조기 진단은 두 번째 수술에 대한 추가 비용없이 항생제로 성공적으로 박멸 할 수 있습니다. 여기에서 XELCI는 높은 X선 해상도, 임플란트 특이성 및 이식된 의료 기기 표면 근처의 비침습적 이미지 화학 농도에 대한 화학적 민감성을 가진 기술로 설명합니다. 장치는 화학적으로 보고되는 표면으로 코팅되어 있습니다. 이 화학적으로 반응하는 표면은 이식 가능한 의료 기기에 코팅 된 두 개의 층으로 구성됩니다. 모니터링을 위해 적색 발광 섬광체(Gd2O2S:Eu) 층 위에 코팅되는 pH 민감성 층(브로모티몰 블루 또는 브로모크레졸 그린 혼입 하이드로겔)을 포함한다. 집속된 X선 빔이 임플란트의 한 지점을 조사하고 섬광체에서 생성된 적색광(620nm 및 700nm 피크 포함)이 감지층을 통과하여 pH에 따라 스펙트럼 비율이 변경됩니다. 임플란트를 가로질러 X선 빔을 스캔하고 조직을 통과하는 빛의 스펙트럼 비율을 점별로 측정하여 이미지를 생성합니다. 우리는 수정된 이식형 플레이트 센서로 이전에 대퇴골의 뼈 표면에서 임플란트 관련 감염을 모니터링하기 위해 이 이미징 기술을 사용했습니다. 이제 우리는 경골 골수내 막대 감염으로 인해 발생하는 pH 변화를 연구하고 있습니다. 파일럿 전 토끼 연구에는 두 가지 유형의 골수내 막대 디자인이 사용되었으며, XELCI 기술을 사용하여 뼈 표면뿐만 아니라 뼈 내부에서도 발생하는 화학적 변화를 모니터링할 수 있다는 것을 알게 되었습니다. 따라서 이를 통해 비침습적이고 높은 공간 분해능, 낮은 배경 국소 pH 이미징을 통해 임플란트 관련 감염 생화학을 연구할 수 있습니다.
Introduction
미국에서는 매년 약 200만 개의 골절 고정 장치가 삽입되며, 그 중 5%-10%가 임플란트 관련 감염을 유발한다1. 이러한 감염은 생물막의 이질성과 항생제 내성 특성으로 인해 후기 단계에서 항생제로 치료하기가 더 어렵습니다 2,3. 조기에 진단되면 항생제와 외과적 괴사조직 제거술로 감염을 치료하여 치료된 골절 부위의 하드웨어를 교체하기 위한 두 번째 수술에 대한 추가 의료 비용을 방지할 수 있습니다. 일반 방사선 촬영 및 기타 고급 방사선 촬영 기술은 정형외과 임플란트 관련 감염, 불유합 및 관련 합병증의 진단에 적용됩니다. 이러한 기술은 정형외과 임플란트에서 주변 뼈와 조직의 구조적 정보를 획득하는 데 자주 사용되지만 특정 환경에서 생화학적 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서 우리는 임플란트 부위에서 비침습적으로 생화학 정보를 고해상도 이미징하기 위한 새로운 X선 여기 발광 화학 이미징(XELCI) 기술을 개발했습니다. 정형 외과 임플란트 관련 감염의 진단은 일반적으로 하나 또는 다른 수단의 조합에 의해 수행됩니다. 임상 관찰 (통증, 부기, 발적, 상처 분비물 등)은 감염의 첫 징후를 시사합니다. 나중에, 뼈 치유 진행의 실패를 확인하고 병원성 유기체 4,5를 확인하기 위해 방사선 및 실험실 실험이 수행된다. 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 핵 의약 기술 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 및 양전자 방출 단층 촬영 (PET)과 같은 방사성 뉴클레오티드 방법은 감염된 임플란트 및 관련 감염의 더 나은 시각화를 위해 사용됩니다 6,7. CT와 MRI는 각각 골 괴사와 연조직 이상을 판별하는 데 유리하지만, 금속 임플란트에 가까운 거리에서 간섭을 일으킨다8. 임플란트 관련 골수염을 진단하기 위해 생체 내 영상 조영제로서 방사성 동위원소 표지 분석물과 결합된 SPECT 및 PET와 같은 다양한 X선 방법론이 널리 활용되고 있다2. 현재 응용 분야는 CT 스캐닝 데이터와 SPECT 또는 PET의 라벨링 데이터를 결합하여 해부학적 정보를 생성합니다9. 이러한 이미징 양식 중 하나 이상이 감염 진단을 돕기 위해 사용되지만 추가 의료 및 수술 비용을 피하기 위해 항생제 치료를 시작하기 위해 감염과 관련된 pH 변화를 조기에 감지할 수 없습니다.
임플란트 관련 감염을 모니터링하기 위해 이 연구에 사용된 이미징 시스템을 활용하는 주요 이점은 스펙트럼 참조를 통해 생물막 미세 환경에 대한 생화학적 정보를 밝힐 수 있다는 것입니다. 주요 초점은 감염된 부위의 이미징 및 pH 매핑에 있지만 이 방법은 임플란트 관련 감염에 특이적인 다른 바이오마커를 모니터링하도록 변경할 수 있습니다. 따라서 XELCI를 통해 감염의 병태생리학을 이해할 수 있습니다. 높은 공간 해상도 이미징을 통해 감염이 증가함에 따라 이질성을 매핑할 수 있습니다. 생물막 형성이 일어나는 표면의 pH는 생화학적 변화를 이해하는 데 매우 중요합니다. 또한, 박테리아10,11에 의한 항생제 관련 스트레스 반응으로 인해 다른 미세 환경 변화가 발생할 수 있다. 표면 특이적 및 높은 공간 분해능 이미징으로 인해 생물막 미세 환경에 대한 항생제 효과를 모니터링할 수 있습니다. 이 기술은 표적 약물 전달 실험을 위한 생물막 환경을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리는 표적 낮은 pH 약물 방출 또는 pH를 높여 더 높은 pH에서 작용하기 쉽게 만들 수 있습니다.
이 이미징 기술의 세 가지 특정 특성은 X선 해상도, 임플란트 표면 특이성 및 화학적 민감도입니다(그림 1A). 이러한 특성은 정형외과 임플란트 관련 감염을 이미징하기 위해 현재 사용 가능한 이미징 기술과 비교할 수 있습니다(그림 1B). X선이 조사되면 임플란트 표면에 코팅된 형광체 입자는 조직의 몇 센티미터를 통과할 수 있는 적색 및 근적외선(NIR) 빛을 생성합니다(약간의 감쇠가 있긴 하지만)12,13. 표 1은 생물막 또는 조직을 통해 pH를 측정하는 데 사용된 다른 방법과 비교하여 개발된 이미징 시스템의 일부 기능을 보여줍니다.
XELCI는 그림 2와 같이 X선 여기와 결합하여 이식된 의료 기기 근처에서 광학적으로 높은 공간 분해능의 화학 정보를 획득하는 새로운 이미징 기술입니다. 여기서는 X선 여기성 형광체 입자의 선택적 여기 및 광학 검출이 활용됩니다. 임플란트는 신틸레이터 입자 층 위에 pH 민감성 염료가 포함된 폴리머 층인 두 개의 층으로 코팅됩니다. 일련의 집속 X선 빔이 임플란트를 조사하면 섬광체 층이 가시광선(620nm 및 700nm)을 생성합니다. 이렇게 생성된 빛은 pH 민감층을 통과하여 주변 환경의 pH에 따라 발광 스펙트럼을 조절합니다. 낮은 pH는 일반적으로 감염 및 생물막 형성과 관련이 있습니다. 감염이 진행됨에 따라 pH는 생리학적 pH(pH 7.2)에서 산성(pH 7 미만)으로 변하고 센서의 pH 염료는 색상과 흡광도를 변화시킵니다. 발광 스펙트럼의 변화는 pH 7 및 pH 4에서 브로모크레졸 녹색 pH 염료에 대한 그림 2E에 나와 있습니다. 조직과 뼈를 통해 투과된 빛이 수집되고 스펙트럼 비율이 pH를 결정합니다. pH 이미지를 생성하기 위해 집속된 X선 빔은 신틸레이터 필름에 한 번에 한 지점씩 조사하고 샘플 전체에 걸쳐 빔을 포인트별로 스캔합니다. 이전에는, 이 기술이 정형외과용 임플란트14,15의 표면의 이미지 pH 변화에 적용되었고, 뼈 및 조직을 통한 골수내 관내의 pH 변화를 모니터링하기 위해 이를 시험하였다.
아래 그림 3은 이미징 시스템의 개략도를 보여줍니다. 이미징 시스템의 기본 구성 요소는 폴리 모세관 광학 장치가 있는 X선 여기 소스, 두 개의 광전자 증배관에 연결되는 일체형 아크릴 광 가이드, X, Y 및 Z 전동 스테이지(30cm x 15cm x 6cm 이동) 및 데이터 수집을 위해 연결된 컴퓨터입니다. X선 소스, x, y, z 스테이지 및 수집 광학 장치(엘보우, 라이트 가이드, 광전자 증배관(PMT))는 X선 방지 인클로저에 있으며, X선 컨트롤러, PMT용 전원, 데이터 수집(DAQ) 보드 및 컴퓨터에 연결된 함수 발생기는 외부에 보관됩니다. 인클로저와 도어 전면 사이에 배치된 푸시 버튼(상시 개방 스위치)은 인터록 역할을 합니다. 도어가 완전히 닫히지 않은 경우(인터록 스위치가 열려 있는 경우) X선 소스가 켜지지 않고 작동 중에 열리면 X선 소스가 자동으로 꺼집니다. 모터는 연속 스캔을 실행할 수 있을 뿐만 아니라 개별 위치로 이동할 수 있습니다. y축의 스캔 속도는 일반적으로 1-5mm/s인 반면 x축의 스텝 크기는 일반적으로 150-2000μm에서 선택할 수 있습니다. 매개변수는 필요한 공간 분해능에 따라 선택할 수 있습니다. 연속 스캔을 통해 일정한 속도로 균일한 노출 시간을 확인할 수 있습니다.
집속된 X선 빔이 X선 발광 입자에 조사되면 생성된 빛은 주변 pH에 따라 빛을 변조하여 pH 감응막을 통과합니다. 투과된 빛은 조직과 상호 작용(부분적으로 산란 및 흡수)하는 반면, 산란 및 흡수에 의한 광 감쇠는 조직 두께가 증가함에 따라 증가합니다. 컬렉션 광학 장치에는 시작 부분에 반사 알루미늄 엘보우(90° 굽힘 및 광택 반사 내부 표면 포함)가 장착된 일체형 분기 아크릴 라이트 가이드가 포함됩니다. 이는 빛이 라이트 가이드에 도달하자마자 빛이 시준되도록 하기 위한 것입니다. 이러한 추가는 집광 효율을 크게 향상시켰습니다. 자세한 내용은 그림 4 에 엘보우와 라이트 가이드의 기계 도면이 나와 있습니다. 90° 엘보는 알루미늄으로 가공되었으며 내부 표면은 경면 마감 처리되었으며 라이트 가이드는 아크릴로 가공되었습니다. 또한 팔꿈치 시작 부분에 광범위한 장거리 통과 청색광 필터(350-450nm 빛 차단)를 부착하여 적색광만 통과하도록 했습니다. 일체형 아크릴 라이트 가이드의 끝은 두 개의 다른 PMT로 이어지는 두 개의 스트림으로 분기됩니다. PMT는 PMT를 ~5°C로 냉각하기 위해 열전 냉각기와 접촉하는 작은 기밀 금속 상자에 들어 있습니다. PMT 중 하나의 시작 부분에는 700nm 빛만 측정하기 위해 협범위 롱패스 필터(570-640nm 광 차단 및 640-740nm 광 통과)가 부착됩니다. 따라서 620nm 및 700nm 빛은 별도로 계산할 수 있습니다. PMT는 광자 계수 모드로 설정되며 검출된 각 광자에 대해 TTL(트랜지스터-트랜지스터 로직) 펄스를 생성합니다. DAQ 시스템은 USB 통신을 사용하여 펄스(포화점 2,000만 펄스/초)를 계산합니다. 데이터를 처리한 후 두 개의 개별 강도 맵이 생성되고 신호 파장 강도(620nm)와 기준 파장 강도(700nm)의 비율을 고려하여 최종 이미지가 생성됩니다. 이 비율은 전체 집광 효율의 차이를 설명하며, 이는 집광 광학 장치의 위치, X선 조사 강도 및 조직 두께에 따라 크게 달라집니다. 또한, pH 지시약 염료 없이 공간적으로 분리된 기준 영역은 파장 의존적 조직 침투로 인한 스펙트럼 왜곡을 설명합니다. 이미징 시스템을 제어하기 위해 그래픽 기반 프로그래밍 언어가 사용되며 작업의 기본 순서도가 아래에 나와 있습니다. 컴퓨터, X선 컨트롤러 및 DAQ 유닛을 제외한 이미징 설정은 방사선 노출을 최소화하기 위해 안전한 X선 인클로저에 포함되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정형외과용 임플란트 관련 감염을 조기에 발견하고 연구하여 골수염 및 2차 수술로 인한 합병증을 예방할 수 있도록, XELCI를 새로운 기능적 영상 기술로 도입했습니다. 조직을 통한 pH 모니터링을 위해 현재 사용 가능한 기술과 비슷합니다.
이미징을 위해 샘플을 배치하는 동안 90° 각도로 교차하는 두 개의 선 모양 레이저 포인터가 있는 다모세관 초점 광학 장치에 연결된 레?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Clemson University, COMSET 및 Clemson SC BioCRAFT에 감사드립니다. XELCI 설정은 처음에 NSF CAREER CHE 12255535의 자금으로 개발되었으며 이후 NIH NIAMS R01 AR070305-01에서 개발되었습니다.
Materials
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
Referencias
- Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
- Renick, P., Tang, L., Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. Device-related infections. Racing for the Surface. , 171-188 (2020).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
- Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
- vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
- Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
- Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
- Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
- Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
- Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
- Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
- Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
- Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
- Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
- Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE – The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
- Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223 (2019).
- Yang, Y., Wang, K. -. Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
- Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469 (2012).
- Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
- Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
- Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
- Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
- Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).
