축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극
Summary
본 프로토콜은 미세유체 챔버에서 뉴런 미토콘드리아의 파종 및 염색을 기술한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 축삭에서 미토콘드리아를 선택적으로 처리하여 세포체 구획에 영향을 미치지 않고 약리학적 문제에 대응하여 특성을 분석할 수 있도록 합니다.
Abstract
미토콘드리아는 뉴런에서 ATP(아데노신 삼인산)의 주요 공급원입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 많은 신경 퇴행성 질환에서 일반적인 표현형입니다. 일부 축삭의 정교한 구조와 극단적인 길이를 감안할 때 축삭의 미토콘드리아가 세포체와 비교하여 다른 환경을 경험할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 흥미롭게도, 축삭 미토콘드리아의 기능 장애는 종종 세포체에 미치는 영향에 선행합니다. 시험관 내에서 축삭 미토콘드리아 기능 장애를 모델링하기 위해, 미세 유체 장치는 체멀 미토콘드리아에 영향을주지 않고 축삭 미토콘드리아의 치료를 가능하게한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 구배에 대한 분자의 확산을 방지하여 축삭 내의 국소 약리학적 문제에 대한 반응으로 미토콘드리아 특성을 분석할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 미세 유체 장치에서 해리 된 해마 뉴런의 파종, 막 전위에 민감한 염료로 염색, 미토콘드리아 독소로 처리 및 후속 현미경 분석을 설명합니다. 축삭 생물학을 연구하는이 다목적 방법은 많은 약리학 적 섭동 및 영상 판독에 적용될 수 있으며 여러 신경 아형에 적합합니다.
Introduction
미토콘드리아는 뉴런에서 ATP(아데노신 삼인산)의 주요 공급업체입니다. 신경 건강은 미토콘드리아 기능과 밀접한 관련이 있기 때문에 이러한 세포 기관의 기능 장애 조절이 파킨슨 병1을 포함한 다양한 신경 퇴행성 질환의 발병과 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 또한, 미토콘드리아 중독은 동물2에서 파킨슨 증상을 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 동물 모델과 인간 질병 모두에서 뉴런의 소멸은 원위 부분 3,4에서 시작하여 축삭 미토콘드리아가 모욕에 더 취약 할 수 있음을 암시합니다. 그러나, 축삭에서 미토콘드리아의 생물학은 세포체 과정의 동시 교란없이 축삭 미토콘드리아의 표적 치료 및 분석과 관련된 어려움으로 인해 잘 이해되지 않는다.
시험관 내에서 해리된 뉴런의 배양 기술의 최근 발전은 이제 미세유체 장치5를 통해 축삭과 세포체의 유체 분리를 가능하게 한다. 그림 1A에 표시된 것처럼 이 장치에는 4개의 액세스 웰(a/h 및 c/i)이 있으며 각 쌍(d 및 f)을 연결하는 2개의 채널이 있습니다. 대형 채널은 일련의 450μm 길이의 마이크로 채널(e)에 의해 서로 연결됩니다. 두 챔버 사이의 충전 레벨의 의도적 인 차이는 유체 압력 구배 (그림 1B)를 생성하여 유체 레벨이 낮은 채널에서 다른쪽으로 작은 분자가 확산되는 것을 방지합니다 (그림 1C, Trypan blue 염료로 표시됨).
우리는 최근에 손상된 미토콘드리아6의 선택적 제거인 축삭 미토파지의 국소 번역 요구 사항을 연구하기 위해 미세 유체 장치를 사용했습니다. 본 프로토콜에서, 미토콘드리아 콤플렉스 III 억제제 안티마이신 A 6,7을 사용하는 축삭의 선택적 처리를 통해 국소 미토콘드리아 손상을 유도하는 상이한 단계가 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 해리된 해마 뉴런을 미세유체 장치에서 시드 및 배양하여 축삭 미토콘드리아를 별도로 처리하는 방법을 기술한다. 막 민감성 염료 TMRE 및 복합 III 억제제 안티마이신 A(이전에 입증된바와 같이7)에 대한 이 접근법의 유용성이 여기에서 입증되지만, 이 방법은 국부적 현미경 기반 판독을 허용하는 다른 미토콘드리아 염료 또는 미토콘드리아 기능의 유전적으로 암호…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 독일 연구 재단 (HA 7728 / 2-1 및 EXC2145 프로젝트 ID 390857198)과 막스 플랑크 학회의 지원을 받았습니다.
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
Referencias
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