微流体辅助轴突线粒体选择性去极化
Summary
本协议描述了微流体室中神经元线粒体的播种和染色。这些腔室中的流体压力梯度允许选择性处理轴突中的线粒体，以分析其性质以应对药理学挑战而不影响细胞体区室。
Abstract
线粒体是神经元中ATP（三磷酸腺苷）的主要供应商。线粒体功能障碍是许多神经退行性疾病的常见表型。鉴于一些轴突的复杂结构和极端的长度，与细胞体对应物相比，轴突中的线粒体可以经历不同的环境也就不足为奇了。有趣的是，轴突线粒体的功能障碍通常先于对细胞体的影响。为了在体 外模拟轴突线粒体功能障碍，微流体装置允许在不影响体细胞线粒体的情况下治疗轴突线粒体。这些腔室中的流体压力梯度阻止了分子逆梯度扩散，从而允许分析线粒体特性以响应轴突内的局部药理学挑战。目前的协议描述了在微流体装置中分离的海马神经元的接种，用膜电位敏感染料染色，用线粒体毒素处理以及随后的显微镜分析。这种研究轴突生物学的通用方法可以应用于许多药理学扰动和成像读数，并且适用于几种神经元亚型。
Introduction
线粒体是神经元中ATP（三磷酸腺苷）的主要供应商。由于神经元健康与线粒体功能密切相关，因此这些细胞器的功能失调与各种神经退行性疾病（包括帕金森病）的发作有关也就不足为奇了1。此外，线粒体中毒已成功用于模拟动物的帕金森病症状2。在动物模型和人类疾病中，神经元的死亡始于远端3，4，这表明轴突线粒体可能更容易受到侮辱。然而，轴突中线粒体的生物学尚不清楚，因为与轴突线粒体的靶向治疗和分析相关的困难，而不会同时干扰细胞体过程。
体外解离神经元培养技术的最新进展现在允许通过微流体装置对轴突和细胞体进行流体分离5。如图1A所示，这些器件具有四个接入井（a/h和c/i），每对（d和f）有两个通道连接。大通道通过一系列450μm长的微通道（e）相互连接。两个腔室之间填充水平的故意差异会产生流体压力梯度（图1B），防止小分子从液位较低的通道扩散到另一侧（图1C，用台盼蓝染料说明）。
我们最近使用微流体装置来研究轴突线粒体自噬的局部翻译要求，即选择性去除受损线粒体6。在本协议中，提出了通过使用线粒体复合物III抑制剂抗霉素A6，7选择性治疗轴突来诱导局部线粒体损伤的不同步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了一种在微流体装置中播种和培养解离的海马神经元以分别治疗轴突线粒体的方法。本文展示了这种方法与膜敏感染料TMRE和复合物III抑制剂抗霉素A（如前所述7）的实用性，但该方法可以很容易地适应其他线粒体染料或线粒体功能的遗传编码传感器，允许局部的，基于显微镜的读数9。其他神经元细胞类型也可以在微流体室中生长，例如原代皮质神经…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了德国研究基金会（HA 7728/2-1和EXC2145项目编号390857198）和马克斯普朗克学会的支持。
Materials
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
Referencias
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