Surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre
Summary
Cet article décrit un protocole pour la surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre.
Abstract
La méthylation de la cytosine est hautement conservée chez les espèces de vertébrés et, en tant que facteur clé de la programmation épigénétique et de l’état de chromatine, joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire précoce. Les modifications enzymatiques entraînent la méthylation active et la déméthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC) et l’oxydation ultérieure de la 5-mC en 5-hydroxyméthylcytosine, 5-formylcytosine et 5-carboxylcytosine. La reprogrammation épigénétique est une période critique du développement in utero , et l’exposition maternelle aux produits chimiques a le potentiel de reprogrammer l’épigénome dans la progéniture. Cela peut potentiellement entraîner des résultats indésirables tels que des conséquences phénotypiques immédiates, des effets à long terme sur la susceptibilité aux maladies chez l’adulte et des effets transgénérationnels des marques épigénétiques héréditaires. Bien que le séquençage à base de bisulfite permette aux chercheurs d’interroger la méthylation de la cytosine à une résolution par paire de bases, les approches basées sur le séquençage sont coûteuses et, en tant que telles, empêchent la capacité de surveiller la méthylation de la cytosine à tous les stades de développement, les concentrations multiples par produit chimique et les embryons répliqués par traitement. En raison de la facilité de l’imagerie in vivo automatisée, des manipulations génétiques, du temps de développement ex utero rapide et de l’élevage pendant l’embryogenèse, les embryons de poisson zèbre continuent d’être utilisés comme modèle physiologiquement intact pour découvrir les voies médiées par les xénobiotiques qui contribuent à des résultats indésirables au cours du développement embryonnaire précoce. Par conséquent, en utilisant des anticorps spécifiques au 5-mC disponibles dans le commerce, nous décrivons une stratégie rentable pour une surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation de la cytosine dans des embryons de poisson-zèbre intacts individuels en tirant parti de l’immunohistochimie à montage entier, de l’imagerie automatisée à haut contenu et du traitement efficace des données à l’aide du langage de programmation avant l’analyse statistique. Selon les connaissances actuelles, cette méthode est la première à détecter et à quantifier avec succès les niveaux de 5-mC in situ dans les embryons de poisson zèbre au cours du développement précoce. La méthode permet la détection de la méthylation de l’ADN dans la masse cellulaire et a également la capacité de détecter la méthylation de la cytosine des ARNm maternels localisés par le jaune au cours de la transition mère-zygote. Dans l’ensemble, cette méthode sera utile pour l’identification rapide des produits chimiques susceptibles de perturber la méthylation de la cytosine in situ lors de la reprogrammation épigénétique.
Introduction
Les modifications enzymatiques entraînent la méthylation active et la déméthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC) et l’oxydation ultérieure de la 5-mC en 5-hydroxyméthylcytosine, 5-formylcytosine et 5-carboxylcytosine 1,2. Le phosphate de tris(1,3-dichloro-2-propyle) (TDCIPP) est un retardateur de flamme largement utilisé aux États-Unis dont il a déjà été démontré qu’il modifie la trajectoire de méthylation de la cytosine après une exposition embryonnaire précoce de 0,75 heure après la fécondation (HPF) jusqu’à la gastrulation précoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Chez les vertébrés, le 5-mC et ses dérivés modifiés sont essentiels pour réguler le développement embryonnaire précoce9. La fécondation d’un embryon déclenche la déméthylation de l’ADN parental, suivie de la dégradation de l’ARNm maternel, de l’activation du génome zygotique et de la reméthylation du génome zygotique9. Les processus biologiquement pertinents qui utilisent la méthylation de la cytosine comprennent la modification des histones, le recrutement de la machinerie transcriptionnelle, la méthylation de l’ARN, la reprogrammation épigénétique et la détermination de la structure de la chromatine10,11. La méthylation de la cytosine est également conservée chez les espèces de vertébrés, ce qui souligne l’importance de comprendre et d’étudier comment la méthylation aberrante de la cytosine peut affecter la trajectoire du développement d’un organisme11. De plus, le développement in utero est sensible à l’exposition maternelle et peut entraîner des effets indésirables tels que des conséquences phénotypiques immédiates, des effets à long terme sur la susceptibilité aux maladies chez l’adulte et des effets transgénérationnels des marques épigénétiques héréditaires12,13,14.
De longues étendues de paires cytosine-guanine, ou îlots CpG, ont été les principaux foyers d’intérêt des chercheurs qui visent à caractériser la dynamique de la méthylation de la cytosine dans le génome15,16,17. Les stratégies à base de bisulfite telles que le séquençage du bisulfite du génome entier, le séquençage du bisulfite à représentation réduite et le séquençage de l’amplicon du bisulfite représentent l’étalon-or pour interroger la méthylation de la cytosine à la résolution par paire de bases. Cependant, les approches basées sur le séquençage sont d’un coût prohibitif et, en tant que telles, empêchent la capacité de surveiller la méthylation de la cytosine à tous les stades de développement, à des concentrations multiples par produit chimique et de répliquer les embryons par traitement. En outre, les approches basées sur le séquençage ne fournissent pas d’informations sur la localisation spatiale, ce qui est essentiel pour comprendre les types de cellules et les zones potentiellement affectées au sein d’un embryon en développement. De même, les tests globaux de méthylation de l’ADN tels que l’analyse de restriction dépendante de la méthylation, les tests immunologiques enzymatiques (ELISA) de 5-mC et la chromatographie liquide par spectrométrie de masse (LC-MS) de la 5-méthyl-2′-désoxycytidine (5-mC) reposent sur des homogénats cellulaires ou tissulaires et, en tant que tels, empêchent la capacité de surveiller la localisation et l’ampleur de la méthylation de la cytosine dans l’espace et le temps dans des échantillons intacts12,18.
En raison de la facilité de l’imagerie in vivo automatisée, des manipulations génétiques, du temps de développement ex utero rapide et de l’élevage pendant l’embryogenèse, les embryons de poisson zèbre continuent d’être largement utilisés comme modèles physiologiquement intacts pour découvrir les voies médiées par les xénobiotiques qui contribuent à des résultats indésirables au début du développement embryonnaire. Par conséquent, en utilisant des anticorps disponibles dans le commerce spécifiques au 5-mC, le protocole ci-dessous décrit une stratégie rentable pour une surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation de la cytosine dans des embryons de poisson-zèbre intacts individuels en tirant parti de l’immunohistochimie (IHC), de l’imagerie automatisée à haut contenu et du traitement efficace des données à l’aide du langage de programmation avant l’analyse statistique.
Selon les connaissances actuelles, cette méthode est la première à surveiller le 5-mC dans des embryons de poisson zèbre intacts. La méthode permet la détection de la méthylation de l’ADN dans la masse cellulaire et a également la capacité de détecter la méthylation de la cytosine des ARNm maternels localisés par le jaune au cours de la transition mère-zygote. Dans l’ensemble, cette méthode sera utile pour l’identification rapide des produits chimiques susceptibles de perturber la méthylation de la cytosine in situ lors de la reprogrammation épigénétique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de ce protocole, il y a quelques étapes qui sont critiques. Tout d’abord, lors de la déchorionisation des embryons, il est important de pointer l’aiguille loin du tissu de l’embryon / sac vitellin / masse cellulaire, car ces parties de l’embryon en développement sont très fragiles et faciles à percer. Deuxièmement, lors du transfert d’embryons marqués vers des puits individuels, utilisez une pipette en verre pour transférer les embryons, car ils adhéreront à une pipette en plastique. Troisiè…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien à la recherche a été fourni par une bourse de la division des études supérieures de l’UCR à SAB, une bourse du programme de formation T32 de la NRSA (T32ES018827) à SAB, et une subvention des National Institutes of Health (R01ES027576) et le projet Hatch (1009609) de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à DCV.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
Referencias
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