Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.
Die räumliche Organisation des Genoms trägt zu seiner Funktion und Regulation in vielen Kontexten bei, einschließlich Transkription, Replikation, Rekombination und Reparatur. Das Verständnis der genauen Kausalität zwischen Genomtopologie und -funktion ist daher von entscheidender Bedeutung und zunehmend Gegenstand intensiver Forschung. Technologien zur Erfassung von Chromosomenkonformationen (3C) ermöglichen es, auf die 3D-Struktur des Chromatins zu schließen, indem die Häufigkeit der Interaktionen zwischen einer beliebigen Region des Genoms gemessen wird. Hier beschreiben wir ein schnelles und einfaches Protokoll zur Durchführung von Capture Hi-C, einer 3C-basierten Target-Anreicherungsmethode, die die allelspezifische 3D-Organisation von megabasierten genomischen Targets mit hoher Auflösung charakterisiert. Bei Capture Hi-C werden die Zielregionen mit einer Reihe von biotinylierten Sonden erfasst, bevor eine nachgeschaltete Hochdurchsatzsequenzierung erfolgt. Dadurch wird eine höhere Auflösung und Allelspezifität erreicht und gleichzeitig die Zeiteffektivität und Erschwinglichkeit der Technologie verbessert. Um seine Stärken zu demonstrieren, wurde das Capture Hi-C-Protokoll auf das X-Inaktivierungszentrum (Xic) der Maus angewendet, den wichtigsten regulatorischen Ort der X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI).
Das lineare Genom enthält alle Informationen, die ein Organismus benötigt, um die Embryonalentwicklung zu durchlaufen und das gesamte Erwachsenenalter zu überleben. Die Anweisung genetisch identischer Zellen, unterschiedliche Funktionen auszuführen, ist jedoch von grundlegender Bedeutung, um genau zu kontrollieren, welche Informationen in bestimmten Kontexten verwendet werden, einschließlich verschiedener Gewebe und/oder Entwicklungsstadien. Es wird angenommen, dass die dreidimensionale Organisation des Genoms an dieser genauen räumlich-zeitlichen Regulation der Genaktivität beteiligt ist, indem sie die physikalische Interaktion zwischen regulatorischen Elementen, die im linearen Genom durch mehrere hundert Kilobasen voneinander getrennt sein können, erleichtert oder verhindert (für Übersichtsarbeiten 1,2,3). In den letzten 20 Jahren hat sich unser Verständnis des Zusammenspiels zwischen Genomfaltung und -aktivität rapide verbessert, was vor allem auf die Entwicklung von Technologien zur Erfassung von Chromosomenkonformationen (3C) zurückzuführen ist (für Review 4,5,6,7). Diese Methoden messen die Häufigkeit von Interaktionen zwischen beliebigen Regionen des Genoms und beruhen auf der Ligation von DNA-Sequenzen, die sich in unmittelbarer 3D-Nähe innerhalb des Zellkerns befinden. Die gebräuchlichsten 3C-Protokolle beginnen mit der Fixierung von Zellpopulationen mit einem Vernetzungsmittel wie Formaldehyd. Das vernetzte Chromatin wird dann mit einem Restriktionsenzym verdaut, obwohl auch der MNase-Verdau verwendet wurde 8,9. Nach dem Verdauen werden freie DNA-Enden in unmittelbarer räumlicher Nähe religiert und die Vernetzung rückgängig gemacht. Dieser Schritt führt zur 3C-“Bibliothek” oder “Vorlage”, einem gemischten Pool von Hybridfragmenten, in dem Sequenzen, die sich in 3D-Nähe zum Zellkern befanden, eine höhere Wahrscheinlichkeit haben, im selben DNA-Fragment ligiert zu werden. Die nachgelagerte Quantifizierung dieser Hybridfragmente ermöglicht es, auf die 3D-Konformation von Genomregionen zu schließen, die im linearen Genom Tausende von Basenpaaren voneinander entfernt liegen, aber im 3D-Raum interagieren könnten.
Es wurden viele verschiedene Ansätze entwickelt, um die 3C-Bibliothek zu charakterisieren, die sich sowohl darin unterscheiden, welche Untergruppen von Ligationsfragmenten analysiert werden, als auch in der Technologie, die für ihre nachgelagerte Quantifizierung verwendet wird. Das ursprüngliche 3C-Protokoll stützte sich auf die Auswahl von zwei Regions of Interest und die Quantifizierung ihrer “Eins-gegen-Eins”-Interaktionshäufigkeit mittels PCR10,11. Der 4C-Ansatz (Circular Chromosome Conformation Capture) misst die Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen Locus von Interesse (d. h. dem “View-Point”) und dem Rest des Genoms (“one versus all”)12,13,14. In 4C durchläuft die 3C-Bibliothek eine zweite Runde des Aufschlusses und der Religation, um kleine zirkuläre DNA-Moleküle zu erzeugen, die durch View-Point-spezifische Primer mittels PCR amplifiziert werden15. 5C (Chromosome Conformation Capture Carbon Copy) ermöglicht die Charakterisierung von 3D-Wechselwirkungen über größere Regionen von Interesse hinweg und liefert Einblicke in die Chromatinfaltung höherer Ordnung innerhalb dieser Region (“viele gegen viele”)16. In 5C wird die 3C-Bibliothek zu einem Pool von Oligonukleotiden hybridisiert, die sich mit Restriktionsstellen überlappen, die anschließend durch Multiplex-PCR mit Universalprimern15 amplifiziert werden können. Sowohl in 4C als auch in 5C wurden die informativen DNA-Fragmente zunächst durch Microarrays und später durch Next-Generation-Sequencing (NGS) quantifiziert17,18,19. Diese Strategien charakterisieren bestimmte Regionen von Interesse, können aber nicht auf die Kartierung genomweiter Interaktionen angewendet werden. Letzteres Ziel wird mit Hi-C erreicht, einer 3C-basierten Hochdurchsatzstrategie, bei der eine massiv parallele Sequenzierung des 3C-Templates die unverzerrte Charakterisierung der Chromatinfaltung auf genomweiter Ebene (“all versus all”) ermöglicht20. Das Hi-C-Protokoll umfasst den Einbau eines biotinylierten Rests an den Enden der verdauten Fragmente, gefolgt von einem Herunterziehen von Ligationsfragmenten mit Streptavidin-Kügelchen, um die Rückgewinnung ligierter Fragmentezu erhöhen 20.
Hi-C zeigte, dass die Genome von Säugetieren im 3D-Zellkern auf mehreren Ebenen strukturell organisiert sind. Auf der Megabasen-Skala wird das Genom in Regionen mit aktivem und inaktivem Chromatin, die A- bzw. B-Kompartimente, unterteilt20,21. Die Existenz weiterer Subkompartimente, die durch unterschiedliche Chromatin- und Aktivitätszustände repräsentiert werden, wurde ebenfalls nachträglich gezeigt22. Bei höherer Auflösung wird das Genom weiter in selbstinteragierende Sub-Megabasen-Domänen unterteilt, die als topologisch assoziierende Domänen (TADs) bezeichnet werden, die erstmals durch Hi-C- und 5C-Analysen der Genome von Mensch und Maus aufgedeckt wurden23,24. Im Gegensatz zu Kompartimenten, die gewebespezifisch variieren, sind TADs tendenziell konstant (obwohl es viele Ausnahmen gibt). Wichtig ist, dass die TAD-Grenzen über Spezies25 hinweg erhalten bleiben. In Säugetierzellen umfassen TADs häufig Gene, die die gleiche regulatorische Landschaft teilen, und es hat sich gezeigt, dass sie einen strukturellen Rahmen darstellen, der die Koregulation von Genen erleichtert und gleichzeitig die Interaktionen mit benachbarten regulatorischen Domänen begrenzt (für Review 3,26,27,28). Darüber hinaus können innerhalb von TADs Wechselwirkungen aufgrund von CTCF-Stellen an der Basis von Cohesin-extrudierten Schleifen die Wahrscheinlichkeit von Promotor-Enhancer- oder Enhancer-Enhancer-Wechselwirkungen erhöhen (für Review29).
In Hi-C können Kompartimente und TADs mit einer Auflösung von 1 Mb bis 40 kb detektiert werden, aber eine höhere Auflösung kann erreicht werden, um Kontakte auf kleinerer Skala zu charakterisieren, wie z. B. Schleifenwechselwirkungen zwischen distalen Elementen auf der Skala von 5-10 kb. Die Erhöhung der Auflösung, um solche Schleifen effizient durch HiC detektieren zu können, erfordert jedoch eine deutliche Erhöhung der Sequenziertiefe und damit der Sequenzierungskosten. Dies wird noch verschärft, wenn die Analyse allelspezifisch sein muss. In der Tat erfordert eine X-fache Erhöhung der Auflösung eine X2-fache Erhöhung der Sequenzierungstiefe, was bedeutet, dass hochauflösende und allelspezifische genomweite Ansätze unerschwinglich teuer sein können30.
Um die Kosteneffizienz und Erschwinglichkeit zu verbessern und gleichzeitig eine hohe Auflösung beizubehalten, können die Zielregionen von Interesse nach ihrer Hybridisierung mit komplementären Biotin-markierten Oligonukleotidsonden vor der nachgelagerten Sequenzierung physisch aus genomweiten 3C- oder Hi-C-Bibliotheken gezogen werden. Diese Strategien zur Target-Anreicherung werden als Capture-C-Methoden bezeichnet und ermöglichen die Untersuchung von Interaktionen von Hunderten von Zielorten, die über das Genom verstreut sind (z. B. Promoter Capture (PC) Hi-C; Capture-C der nächsten Generation (NG); Low Input (LI) Capture-C; Kerntitrierte (NuTi) Capture-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40 oder über Regionen hinweg, die sich über mehrere Megabasen erstrecken (z. B. Capture HiC; HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2); Kachel-C)41,42,43. Zwei Aspekte können bei Capture-basierten Methoden variieren: (1) die Art und das Design von biotinylierten Oligonukleotiden (d. h. RNA oder DNA, einzelne Oligos, die disperse genomische Ziele erfassen, oder mehrere Oligos, die eine Region von Interesse bedecken); und (2) die Vorlage, die zum Herunterziehen von Zielen verwendet wird, bei denen es sich um die 3C- oder Hi-C-Bibliothek handeln kann, wobei letztere aus biotinylierten Restriktionsfragmenten besteht, die aus der 3C-Bibliothek heruntergezogen wurden.
Hier wird ein Capture Hi-C-Protokoll beschrieben, das auf der Anreicherung von Zielkontakten aus der 3C-Bibliothek basiert. Das Protokoll beruht auf dem Design eines maßgeschneiderten Kachelarrays von biotinylierten RNA-Sonden und kann in 1 Woche von der Präparation der 3C-Bibliothek bis zur NGS-Sequenzierung durchgeführt werden. Das Protokoll ist schnell, einfach und ermöglicht die Charakterisierung der 3D-Organisation höherer Ordnung von Regions of Interest in Megabase-Größe bei einer Auflösung von 5 kb bei gleichzeitiger Verbesserung der Zeiteffektivität und Erschwinglichkeit im Vergleich zu anderen 3C-Methoden. Das Capture Hi-C-Protokoll wurde auf den regulatorischen Master-Locus der X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI), das X-Inaktivierungszentrum (Xic), angewendet, das die nicht-kodierende Xist-RNA beherbergt. Der Xic war bereits Gegenstand umfangreicher Struktur- und Funktionsanalysen (für Review44,45). Bei Säugetieren kompensiert XCI die Dosis von X-chromosomalen Genen zwischen Weibchen (XX) und Männchen (XY) und beinhaltet das transkriptionelle Silencing fast der gesamten beiden X-Chromosomen in weiblichen Zellen. Das Xic stellt einen leistungsstarken Goldstandard-Locus für Studien zur 3D-Genomtopologie und dem Zusammenspiel mit der Genregulationdar 44. Die 5C-Analyse des Xic in embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus führte zur Entdeckung und Benennung von TADs und lieferte damit erste Einblicke in die funktionelle Relevanz der topologischen Partitionierung und der Koregulation von Genen24. In der Folge konnte gezeigt werden, dass die topologische Organisation des Xic entscheidend am geeigneten Entwicklungszeitpunkt der Xist-Hochregulation und XCI 46 beteiligt ist, und auch im Xic47,48,49 wurden kürzlich unerwartete cis-regulatorische Elemente entdeckt, die die Genaktivität innerhalb und zwischen TADs beeinflussen können. Die Anwendung von Capture Hi-C auf 3 MB des X-Chromosoms der Maus, das den Xic überspannt, demonstriert die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes bei der Analyse großflächiger Chromatinfaltung mit hoher Auflösung. Es wird ein detailliertes und leicht verständliches Protokoll bereitgestellt, beginnend mit dem Design des Arrays biotinylierter Sonden an jeder DpnII-Restriktionsstelle innerhalb der interessierenden Region über die Generierung der genomweiten 3C-Bibliothek, die Hybridisierung und Erfassung von Zielkontakten bis hin zur nachgelagerten Datenanalyse. Ein Überblick über die geeigneten Qualitätskontrollen und die erwarteten Ergebnisse wird ebenfalls gegeben, und sowohl die Stärken als auch die Grenzen des Ansatzes werden im Lichte ähnlicher bestehender Methoden diskutiert.
Hier beschreiben wir ein relativ schnelles und einfaches Capture Hi-C Protokoll zur Charakterisierung der übergeordneten Organisation von Megabasen-Genomregionen mit einer Auflösung von 5-10 kb. Capture Hi-C gehört zur Familie der Capture-C-Technologien, die entwickelt wurden, um gezielte Chromatin-Interaktionen aus genomweiten 3C- oder Hi-C-Templates anzureichern. Bisher wurde die große Mehrheit der Capture-C-Anwendungen genutzt, um Chromatinkontakte relativ kleiner regulatorischer Elemente zu kartieren, die über das gesamte Genom verstreut sind. Im ersten Capture-C-Protokoll wurden mehrere überlappende RNA-biotinylierte Sonden verwendet, um >400 vorselektierte Promotoren in 3C-Bibliotheken einzufangen, die aus erythroiden Zellen hergestellt wurden31. Die gleiche Strategie wurde später in Next Generation (NG) und Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C verbessert, um hochauflösende Interaktionsprofile von >8.000 Promotoren zu erreichen, indem einzelne 120-bp-DNA-Köder verwendet wurden, die einzelne Restriktionsstellen und zwei aufeinanderfolgende Fangrunden umfassten, um die Anreicherung informativer Ligationsfragmente zu maximieren32,40. Diese Strategien führten zur funktionellen Zerlegung von cis-wirkenden Elementen in vielen verschiedenen Kontexten, einschließlich der embryonalen Entwicklung der Maus, der Zelldifferenzierung, der Inaktivierung des X-Chromosoms und der Fehlregulation von Genen unter pathologischen Bedingungen 46,63,65,66,67,68,69,70,71.
Bei Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) wurden >22.000 annotierte Promotoren, die Restriktionsfragmente enthielten, durch Hybridisierung einzelner RNA 120-mer biotinylierter Sonden an einem oder beiden Enden des Restriktionsfragments aus Hi-C-Bibliotheken gezogen34,72. Diese Methode ermöglichte die Dissektion des Interaktoms von Tausenden von Promotoren in einer schnell wachsenden Anzahl von Zelltypen, darunter embryonale Stammzellen der Maus, fetale Leberzellen und Adipozyten 34,35,72,73, aber auch menschliche lymphoblastoide Linien, hämatopoetische Vorläuferzellen, epidermale Keratinozyten und pluripotente Zellen 37,74,75,76,77.
Im Vergleich zu diesen Technologien zur Target-Anreicherung zielt Capture Hi-C auf zusammenhängende genomische Regionen bis auf die Megabasen-Skala ab, wobei es sich über einen oder mehrere TADs erstreckt und regulatorische Landschaften von Genen umfasst. Die gesamte interessierende Region muss mit einer Reihe von biotinylierten Sonden gekachelt werden, die jede DpnII-Restriktionsstelle innerhalb des Ziels umfassen. Die Hybridisierung des biotinylierten Arrays mit dem 3C-Template, seine anschließende Streptavidin-basierte Erfassung und Verarbeitung für die Multiplex-Sequenzierung erfolgt unter Verwendung eines Target-Anreicherungssystems für die Illumina Paired-End Multiplex-Sequenzierung. Das gesamte Protokoll ist schnell, da es von der 3C-Bibliotheksvorbereitung bis zur NGS-Sequenzierung in 1 Woche durchgeführt werden kann und nur geringfügige Anpassungen und/oder kundenspezifische Fehlerbehebungen erfordert.
Das Protokoll bietet auch Vorteile im Vergleich zu anderen 3C-basierten Methoden. Um Interaktionskarten mit einer Auflösung von 5-10 kb zu erhalten, sequenzierten wir 100-120 M Paired-End-Reads. Zum Vergleich haben wir hier einen Hi-C-Datensatz von 571 Mio. Lesevorgängen verwendet, um eine Auflösung von 20 kb64 (GSM2053973) zu erreichen, und mindestens 1 Milliarde Lesevorgänge wären erforderlich, um eine Auflösung von 5 kb mit chromosomenweitem Hi-C22 zu erreichen.
Capture Hi-C, wie es in der vorliegenden Studie verwendet wird, erreicht eine viel höhere Auflösung als das zuvor veröffentlichte 5C, das auf einem 6-bp-Cutter-Restriktionsenzym47 basiert (ergänzende Tabelle 1). Wichtig ist, dass die Strategie, die darauf abzielt, gezielte Interaktionen in 5C anzureichern und zu verstärken, keine allelspezifische Analyse von Chromatininteraktionen zulässt. Im Gegenteil, Capture Hi-C-Daten können allelspezifisch kartiert werden, was die Zerlegung der 3D-Strukturlandschaften von Paaren homologer Chromosomen ermöglicht, beispielsweise in menschlichen Zellen oder in F1-Hybridzelllinien, die durch Kreuzung genetisch unterschiedlicher Mausstämme entstandensind 78. Um allelspezifische Capture Hi-C-Interaktionskarten mit einer Auflösung von 5 kb zu erstellen, sequenzierten wir 150 bp Paired-End-Reads, um die SNP-Abdeckung zu erhöhen. Ähnliche Allel-spezifische Ansätze können auf humane Zelllinien angewendet werden, für die die Annotation von SNPs verfügbar ist22.
Wichtig ist, dass, obwohl Capture Hi-C im Allgemeinen eine hohe Auflösung gewährleistet und gleichzeitig die Erschwinglichkeit der Sequenzierungskosten verbessert, die Herstellung maßgeschneiderter biotinylierter Oligonukleotide einen Einfluss auf die Gesamtkosten dieser Methode hat. Daher ist die Wahl der am besten geeigneten 3C-Methode für verschiedene Anwendungen unterschiedlich und hängt von der biologischen Fragestellung und der erforderlichen Auflösung sowie von der Größe der interessierenden Region ab. Andere entwickelte Capture Hi-C-Protokolle haben wichtige Funktionen mit dem hier beschriebenen Protokoll gemeinsam. Zum Beispiel wurde eine Capture Hi-C-Strategie angewendet, um ~50 kb bis 1 Mb Genomregionen zu charakterisieren, die nicht-kodierende Varianten umfassen, die mit dem Brust- und Darmkrebsrisiko assoziiert sind. In diesem Protokoll wurden Zielregionen aus Hi-C-Bibliotheken herausgezogen, indem 120-mer-RNA-Köder hybridisiert wurden, wobei die Zielregionen mit einer 3-fachen Abdeckungvon 33,38,79 gekachelt wurden. In ähnlicher Weise wurde HYbrid Capture Hi-C (Hi-C 2) verwendet, um Interaktionen innerhalb von Regions of Interest bis zu2 Mb80 anzuvisieren. In beiden Protokollen erhöhte die Verwendung eines Hi-C-Templates, das für Biotin-Pulled-Down-Ligationsfragmente angereichert wurde, den Prozentsatz der gesamten informativen Reads im Vergleich zu unserem Protokoll. In dem Hi-C-Datensatz, den wir hier für den Vergleich64 verwendet haben (GSM2053973), ist beispielsweise der Prozentsatz der gültigen Paare nach dem Entfernen von Duplikaten 4,8-mal höher als die in Capture Hi-C erhaltenen gültigen Paare, wie in Abbildung 3 und ergänzender Tabelle 1 beschrieben. Das aufeinanderfolgende Herunterziehen von biotinylierten ligierten Fragmenten und hybridisierten Sonden macht das Protokoll jedoch deutlich komplexer und zeitaufwändiger, während die Komplexität der erfassten Region möglicherweise verringert wird.
Eine weitere verfügbare Methode zur Anreicherung von 3C-Templates mit Kachelsonden ist Tiled-C, die zur Untersuchung der Chromatinarchitektur mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung während der erythroiden Differenzierung der Maus eingesetzt wurde43. In Tiled-C wird ein Panel von 70 bp biotinylierten Sonden verwendet, um Kontakte in großräumigen Regionen in zwei aufeinanderfolgenden Erfassungsrunden anzureichern, um sehr hochauflösende Karten gezielter Interaktionen zu erstellen43,81. Die doppelte Capture-Anreicherung macht das Protokoll im Vergleich zu Capture Hi-C auch länger und komplexer. Im Gegensatz zu den Capture-C-Strategien, die auf einzelne Restriktionsstellen abzielen, scheint die zweite Erfassungsrunde in Tiled-C die Erfassungseffizienz jedoch nicht signifikant zu erhöhen und kann daher wahrscheinlich weggelassen werden43. Schließlich wurde ein ähnlicher Kachelansatz, der auf der gleichen Zielanreicherungsstrategie basiert, die in dieser Studie verwendet wurde, auf die Analyse von regulatorischen Landschaften angewendet, die strukturelle Varianten umfassen, die bei Patienten mit angeborenen Fehlbildungen beschrieben und in transgenen Mäusen neu entwickelt wurden41,42. In diesem Fall wurde die Kachelanordnung von Sonden über das gesamte Ziel und nicht in der Nähe von DpnII-Restriktionsstellen41 entworfen. Nichtsdestotrotz war diese Arbeit wegweisend, um die Sensitivität und Leistungsfähigkeit dieser Strategie zur hochauflösenden Charakterisierung großer genomischer Regionen in verschiedenen Kontexten hervorzuheben41,42,48.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll eine einfache, robuste und leistungsfähige Strategie für die hochauflösende 3D-Charakterisierung beliebiger genomischer Regionen von Interesse darstellt. Die Anwendung dieses Ansatzes auf verschiedene Modellsysteme, Zelltypen, entwicklungsregulierte Chromatinlandschaften und Genregulation unter gesunden und pathologischen Bedingungen dürfte unser Verständnis des Zusammenspiels und der Kausalität zwischen Genomtopologie und Genregulation erleichtern, eine der grundlegenden offenen Fragen im Bereich der Epigenetik. Darüber hinaus hat die Anwendung von Capture Hi-C zur Kartierung von langreichweitigen Interaktionen und Chromatinfaltung höherer Ordnung, die in GWAS-Studien identifiziert wurden, das Potenzial, die funktionelle Relevanz von nicht-kodierenden genomischen Loci aufzudecken, die mit menschlichen Krankheiten in verschiedenen Kontexten assoziiert sind, und damit neue Einblicke in die Prozesse zu gewinnen, die möglicherweise der Pathogenese zugrunde liegen.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit im Heard-Labor wurde durch einen Advanced Investigator Award des Europäischen Forschungsrats (XPRESS – AdG671027) unterstützt. A.L. wird durch ein Marie-Skłodowska-Curie-Stipendium der Europäischen Union (IF-838408) unterstützt. A.H. wird vom ITN Innovative and Interdisciplinary Network ChromDesign im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Grant-Vereinbarung 813327 unterstützt. Die Autoren danken Daniel Ibrahim (MPI für molekulare Genetik, Berlin) für hilfreiche technische Ratschläge, der NGS-Plattform am Institut Curie (Paris) und Vladimir Benes und der Genomics Core Facility am EMBL (Heidelberg) für die Unterstützung und Hilfe.
10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Cell Scrapers – 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
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Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
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Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
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Proteinase K – recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
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Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
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Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
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