본 프로토콜은 유전체학, 단백질체학, 마이크로바이옴 또는 기타 분석에 입력하기 위해 손으로 성인 Caenorhabditis elegans 선충으로부터 장을 분리하는 절차를 설명합니다.
단 20개의 세포로 구성된 Caenorhabditis elegans 장은 소화, 신진대사, 노화, 면역 및 환경 반응을 포함한 많은 생명 유지 기능의 연결체입니다. C. elegans 숙주와 그 환경 사이의 중요한 상호 작용은 장내 미생물이 집중되는 장 내에서 수렴됩니다. 따라서 장 조직을 나머지 웜에서 분리하는 능력은 장 특이적 과정을 평가하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 성인 C. elegans 내장을 손으로 해부하는 방법을 설명합니다. 절차는 용이함 또는 훈련 목적을 위해 형광 표지된 균주에서 수행할 수 있습니다. 기술이 완성되면 모든 유전자형의 표지되지 않은 벌레에서 장을 수집 할 수 있습니다. 이 미세 해부 접근법은 숙주 장 조직과 장내 미생물총을 동시에 포획할 수 있게 하며, 이는 많은 미생물군집 연구에 도움이 됩니다. 이와 같이, 이 프로토콜에 의해 생성된 장내 제제에 대한 다운스트림 적용은 장 세포로부터의 RNA 분리 및 포획된 미생물총으로부터의 DNA 분리를 포함할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 전반적으로 C. elegans 장의 손 해부는 장 생물학의 중요한 측면을 조사하는 간단하고 강력한 방법을 제공합니다.
Caenorhabditis elegans 선충류는 959개의 세포와 4일의 난자 대 계란 수명 주기를 가지며 많은 유전학, 유전체학 및 발달 연구 1,2에 이상적인 모델 시스템입니다. 정방향 및 역방향 유전자 스크리닝의 용이성, 조작된 형광 마커의 보급, 뉴클레오티드 특이적 게놈 편집을 수행할 수 있는 능력, 수많은 커뮤니티 전체 리소스는 모두 C. elegans 시스템의 주요 발견과 통찰력에 기여했습니다. 그러나 중요한 단점은 작고 깨지기 쉽고 상호 연결될 수있는 세포, 조직 또는 기관의 순수한 집단을 얻는 것이 어렵다는 것입니다. RNA-seq, ChIP-seq 및 ATAC-seq와 같은 유전체학 분석에는 순수한 세포 집단이 중요하기 때문에 C. elegans 세포, 조직 및 기관의 순수한 제제를 얻기 위한 몇 가지 접근 방식이 등장했습니다. 여기에서는 창자를 큰 부분으로 손으로 해부하는 방법을 성인 C. elegans 벌레에서 설명합니다. 결과 제제는 다운스트림 유전체학 분석에 적합합니다(그림 1).
여기에 설명된 미세 조직 해부 방법(그림 2)은 한 가지 접근 방식일 뿐입니다. 분자 태깅, 웜 분해, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 사후 분석을 통한 관심 세포 유형 정제와 같은 다른 대체 기술도 C. elegans 분자 생물학의 조직 특이적 특징을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 이러한 다른 접근법에 비해 손 해부의 장점은 C. elegans 장의 특징과 박테리아 내용물 3,4,5를 동시에 탐색하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 16S rRNA 유전자 시퀀싱이 가능하고 C. elegans 시스템 내에서 마이크로바이옴 연구를 용이하게 합니다. 그러나 중요한 한계는 장 세포가 개별적으로 분리되지 않는다는 것입니다.
분자 태깅은 지정된 조직 또는 관심 세포 내에서만 분자에 세포 유형별 태그를 부여합니다. 그런 다음 이러한 태그를 전체 웜 준비에서 분리할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 태그된 폴리A-결합 단백질 또는 스플라이싱된 리더를 구동하는 조직-특이적 프로모터는 조직-특이적 전사체 프로파일링 6,7,8,9,10 및 3’UTR 맵핑(11,12)을 가능하게 하였다. 유사하게, 조직-특이적 전사 인자 프로파일은 ChIP-seq 및 DamID를 사용하여 수행되었으며, 여기서 프로모터-특이적 전사 인자 변이체는 태그 또는 효소 융합체13,14로 추가되었다.
FACS는 고유한 세포 특성 및 형광 특성에 기초하여 해리된 웜으로부터 관심 세포 유형을 분리할 수 있게 한다. 이 접근법은 다양한 기관 8,15,16 및 개별 신경 세포 유형 8,9,15,16,17,18에서 조직 특이 적 전사체를 생성했으며 전체 C. elegans 신경계의 발현지도를 만드는 데 사용되었습니다 19,20 . FACS 및 그의 사촌 형광-활성화 핵 분류(FANS)는 또한 세포-특이적 염색질 프로파일21,22를 생성하는데 사용되었다.
마지막으로, 사후 분석은 단일 세포 분해능 분석에서 수행할 수 있습니다. 이 방법에서는 모든 개별 세포를 조사하고 각각의 세포 유형을 분석 단계에 귀속하며 추가 연구를 위해 관심 세포 유형을 선택적으로 필터링합니다. 사후 분석은 C. elegans 배아23,24,25,26,27 및 L1 28 단계 웜에서 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 발달 세포의 전사체를 얻는 데 성공적으로 사용되었습니다. 염색질 접근성은 또한 유사한 전략29를 사용하여 RNA-seq 대신 ATAC-seq를 사용하여 특성화되었습니다.
각 접근 방식에는 장점과 한계가 있습니다. C. elegans 장의 경우 장 세포의 웜 분해 및 FACS 분리는 배아 및 유충 단계30에서 달성 할 수 있지만 성인에서는 어렵습니다. 이것은 장의 크고 내로 복제되며 강하게 부착 된 세포로 인해 손상되지 않은 상태로 해리되기 어렵 기 때문인 것으로 생각됩니다. 여기에 설명 된 손 해부 방법은 이러한 문제를 우회하여 성인 벌레 장의 많은 부분을 분리 할 수 있습니다. 이 같은 단계에서 생식선을 손으로 해부하는 관행은 광범위하고 간단합니다. 장 박리는 생식선 박리와 유사하지만 덜 일반적으로 수행됩니다32. 여기에 제시된 프로토콜은 James McGhee 박사와 Barb Goszczynski가 개발 한 더 긴 미공개 프로토콜에서 채택되었습니다. 이 간소화 된 프로토콜은 초기 단계 배아 23,33,34,35에서 분열구를 분리하는 기술을 차용합니다. 손 해부는 C. elegans에서 대부분의 세포 또는 조직 유형을 분리하는 데 적합하지 않지만 성인 벌레로부터 장을 분리하는 데 이상적입니다. 따라서 손 해부는 장 특이 적 세포 제제를 얻기위한 다른 수단을 보완합니다.
이 기사에서는 성인 C. elegans에서 장을 손으로 해부하여 다운스트림 분석을 위한 순수한 준비를 생성하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 (1) 벌레가 과도하게 마비되지 않도록 하고, (2) 정확한 해부 절단을 하고, (3) 해부를 위해 적절한 크기의 마이크로 피펫을 단조하고, (4) 최종 수확 중에 건강한 장의 빠른 회복을 보장하는 것이 포함됩니다. 이러한 이유로 레바 미솔 용액에 웜을 노출 할 때는주의를 기울여야하며 최대 선명도를 보장하기 위해 피하 주사 바늘을 자주 새로 고쳐야합니다. 미세 모세관 피펫과 구강 흡인기를 사용하여 장을 다루는 것은 연습이 필요한 또 다른 단계입니다. 적절한 크기의 적절하게 단조된 마이크로 피펫은 마이크로 피펫 내에서 장을 잃을 위험을 줄이는 것 외에도 해부 중에 장의 큰 부분을 분리하는 데 상당한 차이를 만듭니다. 새로운 프로토콜 사용자는 일반적으로 분리 시약으로 배출되기 전에 미세 모세관 피펫의 내부 가장자리에서 장을 잃습니다. 이 문제는 연습과 적절하게 단조 된 미세 모세관 피펫으로 수정할 수 있습니다.
본원에 기술된 프로토콜은 성충에서 사용하기 위해 설계되었다. 예비 시험은 이 프로토콜이 L4 웜 및 노인 성인 웜에도 효과적임을 뒷받침합니다. 그러나이 프로토콜의 효능은 초기 애벌레 단계 웜에서 아직 평가되지 않았습니다. 이 접근법의 한계는 그것이 산출하는 재료의 양이 적다는 것입니다. 양은 RNA-seq 및 PCR에 충분하지만 다른 분석에는 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서 사용자는 분석에 필요한 최소 입력을 이 프로토콜로 실현 가능하게 수집할 수 있는지 결정해야 합니다.
우리 연구실은 FACS를 일상적으로 활용하여 분리 후 장 세포를 정제하고30, 장 세포 식별을 위한 사후 분석 방법 및 이 손 해부 방법(30,42)을 사용합니다. 손 해부는 웜 분해 및 세포 분리가 덜 성공적일 때 성인 웜에서 사용할 수 있다는 장점이 있습니다. 또한, 손 해부 제제에서 추출한 총 RNA의 효율성과 품질이 높은데, 이는 조직이 벌레에서 빠르게 뽑힌 다음 핵산 분리 시약에 빠르게 침착되어 RNA 분해를 감소시키기 때문일 수 있습니다. 손 해부 방법의 또 다른 이점은 비용이 저렴하고 배우기 쉬우 며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 마지막으로, 이 접근 방식은 벌레 장에서 장내 박테리아를 수확하고 분리하여 다운스트림 마이크로바이옴 연구를 가능하게 합니다.
성인 C. elegans에서 장을 분리하기 위해 여기에 설명 된 손 해부 프로토콜은 C. elegans 생물학의 다양한 측면을 연구하기위한 강력한 도구입니다 . 예를 들어, 장의 순수한 준비로 연구자들은 면역, 노화, 신진 대사 및 미생물 군집 사이의 교차점을 조사 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 처음에 이 프로토콜이 적용된 장 해부 방법을 개발한 James McGhee와 Barb Goszczynski의 선구적인 작업에 빚을 지고 있습니다. 우리의 연구는 국립 일반 의학 연구소 (국립 보건원, R35GM124877에서 EON까지)가 감독하는 MIRA (R35) 상과 NSF MCB 분자 및 세포 생명 과학 부서가 감독하는 NSF-CAREER 상 (EON에 대한 상 #2143849)의 지원을 받습니다.
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |