Тестирование проницаемости эпителия в энтероидах, полученных из тканей плода

Коллекция тканей человека была одобрена Советом по институциональному обзору Вашингтонского университета (идентификатор исследования: STUDY380 и CR ID: CR3603) и выполнена Исследовательской лабораторией врожденных дефектов. Исследовательская лаборатория врожденных дефектов была поддержана наградой NIH No 5R24HD000836 от Национального института детского здоровья и развития человека Имени Юнис Кеннеди Шрайвер. Образцы были собраны у согласных участников и отправлены как обезличенные и без какой-либо медицинской информации. Образцы тонкой кишки хранились в ледяном фосфатно-буферном солевом растворе Dulbecco (DPBS) и отправлялись на ночь в приемную лабораторию. 1. Подготовка реагентов ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов и каталожные номера приведены в Таблице материалов ; рекомендуемые объемы предназначены для плиты с 6 скважинами, если не указано иное. Приготовьте 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворив 50 мг порошка BSA в 50 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) со 100 мкг / мл антибиотика широкого спектра действия примоцина для покрытия всей пластиковой посуды и наконечников, которые контактируют с тканями или энтероидами.Чтобы покрыть BSA, поместите нефильтрованные наконечники пипеток в коническую трубку объемом 50 мл с достаточным количеством BSA для покрытия наконечников, добавьте 1-2 мл BSA для покрытия поверхности чашки Петри или заполните конические трубки BSA объемом 15 мл в течение не менее 20-30 минут при комнатной температуре перед использованием. Готовят среду DPBS путем смешивания 50 мл DPBS со 100 мкг/мл примоцина и 50 мкг/мл гентамицина. Приготовьте эту среду с амфотерицином 2,5 мкг/мл и без него. Получают энтероидные питательные среды, смешивая 2 мл органоидной питательной среды, 100 мкг/мл примоцина, 10 мкМ Y27632 и 2,5 мкМ CHIR99021. Ежедневно готовьте свежие носители и нагревайте их в инкубаторе клеточных культур при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разрежения для Y27632 составляет 1:250. Для CHIR99021 разбавьте раствор CHIR до 1:100 в теплых средах, а затем до 1:40 в энтероидных питательных средах для достижения разбавления 1:4000. Готовят матричную смесь базальной мембраны, добавляя в запас основную мембранную матрицу 10 мкМ Y27632 и 2,5 мкМ CHIR99021. Сделайте в общей сложности 285 мкл окончательной смеси матрицы базальной мембраны при концентрации белка 8 мг/мл для одной лунки 6-луночной пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Основная мембранная матрица должна быть ледяной, чтобы оставаться в жидкой форме и затвердевать при более высоких температурах. Концентрация белка в матрице базальной мембраны определяет объем, необходимый для получения конечной концентрации белка 8 мг/мл, используя уравнение:Объем 1 × Концентрация 1 = Объем 2 × Концентрация 2 Приготовьте 4% параформальдегида (PFA), разбавив 32% запаса PFA в PBS на 1:8, и храните при комнатной температуре. Сделайте 0,5 мл на каждую лунку энтероидов, подлежащих фиксации. Приготовьте блокирующий буфер, добавив 5% козьей сыворотки и 0,5% Тритона X-100 в PBS. Приготовьте 1 мл для первого антитела на лунку и 0,5 мл для дополнительного антитела на лунку.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сыворотку того же вида, что и хозяин вторичных антител Получают первичные и вторичные антитела, разведенные в блокирующем буфере в концентрации, рекомендованной производителем для каждого антитела. Готовят 5 мкг/мл дмидино-2-фенилиндола (DAPI) путем разбавления до 1:200 из 1 мг/мл стандартного раствора в PBS. Внесите 0,5 мл на лунку окрашенных энтероидов. Приготовьте 70% глицерина в PBS и сделайте 0,5 мл для установки энтероидов на предметные стекла микроскопа. Готовят 5 мг/мл декстран-ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианат), разбавляя 25 мг/мл раствора в PBS в соотношении 1:5. Сделайте 20 мкл для микроинъекции. Приготовьте липополисахариды (ЛПС) и декстран-ФИТЦ путем восстановления порошка ЛПС в ПБС до 5 мг/мл раствора. Разбавляют стоковые растворы ЛПС и декстрана в ПБС до 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл ЛПС и 5 мг/мл декстрана-ФИТЦ. Сделайте 20 мкл для микроинъекции. Получают этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’,N’-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), сделав запасной раствор 0,2 М путем растворения порошка ЭГТА в дистиллированной воде и регулировки рН примерно до 8 с использованием соляной кислоты (HCl). Подготовьте испытательную концентрацию 2 мМ в питательных средах, выполнив разбавление 1:100. 2. Коллекция образцов Как только образцы получены, выполните изоляцию эпителиальных клеток и покрытие в течение 24 часов после сбора образцов. 3. Покрытие эпителиальных клеток кишечника в матрице базальной мембраны из целых образцов ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура следует модифицированным протоколам лаборатории моделирования трансляционных тканей Мичиганского университета 12,13,14. Использование питательных сред с высоким коэффициентом Wnt дает последовательные результаты для энтероидного образования. Как только энтероиды установлены, используйте те же среды с высоким коэффициентом Wnt, чтобы привести энтероиды к сферическим формам для микроинъекции. Переложите сегменты кишечника в чашку Петри размером 60 мм х 15 мм с ледяным DPBS с амфотерицином и замочите на льду в течение 20 мин. Пока ткань пропитывается, определите области (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) тонкой кишки и удалите соединительную ткань и кровеносные сосуды щипцами и ножницами. Вымойте содержимое просвета по мере необходимости, используя небольшую иглу 23-25 г и шприц 3 мл без нарушения эпителия. Нарежьте сегменты кишечника на кусочки по 3-5 мм с помощью скальпеля и поместите 1-2 кусочка (для обшивки в одну лунку 6-луночной пластины) в чашку Петри размером 35 мм х 15 мм, содержащую на льду 0,5-1 мл органоидной питательной среды. С помощью рассечения микроножницы и щипцы разрезают кишечную трубку продольно. Используйте кончик щипцов, чтобы соскоблить эпителиальные клетки с фасции под 10-кратным стереомикроскопом. Удалите фасцию и закрутите блюдо, чтобы разбить сгустки клеток. Используйте наконечник пипетки объемом 20 мкл для переноса клеток и среды с шагом 5-10 мкл в матричную смесь базальной мембраны, чтобы получить раствор 285 мкл при концентрации матричного белка 8 мг/мл. Пипетка вверх и вниз медленно 20x для смешивания клеток в матрице базальной мембраны на льду с помощью разрезанного наконечника 200 мкл. Поместите пять 50 мкл полосок матрицы клеточной базальной мембраны в одну лунку предварительно нагретой 6-луночной пластины, хранящейся на теплом пенопластовом кирпиче. Инкубируют пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C и 5% CO2 в течение 10 мин, чтобы позволить матрице базальной мембраны полимеризоваться и затвердеть. Добавьте 2 мл энтероидной среды роста в лунку затвердевших полосок матрицы базальной мембраны и поместите обратно внутрь инкубатора клеточной культуры. Ежедневно меняйте медиа, чтобы стимулировать рост энтероидов. Ежедневно проверяйте дифференцировку кишечных стволовых клеток под 10-кратным инвертированным микроскопом. Через 10-14 дней пропускают энтероиды в одну лунку из 12-луночной или 6-луночной пластины в зависимости от плотности энтероидов. Начните менять медиа через день и проходите в соотношении 1:2 каждые 5-7 дней, когда энтероиды начнут процветать.Удаляют клетки, которые не дифференцируются в энтероиды, с помощью матричного слоя базальной мембраны во время проходов. Создайте замороженный запас энтероидов с низким проходом, заморозив их в 80% питательной среде, 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS) и 10% диметилсульфоксиде (DMSO), если это необходимо. 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание энтероидов ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс фиксации и окрашивания занимает 3 дня. В этом протоколе мы фиксировали и окрашивали ядра (DAPI), эпителиальные маркеры (villin, CDX2), лизоцим, муцин и белки плотного соединения (клаудин 2, клаудин 3, окклюдин, zonula occluden-1) с использованием модифицированного протокола15. Флуоресцентные снимки были сделаны конфокальным микроскопом. ЗакреплениеПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс обычно выполняется одновременно с энтероидным проходом или процедурой замораживания.Поместите энтероидную пластину на лед. Удалите питательные среды и аккуратно промыть 2x холодными DPBS. Определите энтероиды, подлежащие фиксации и окрашиванию. Переложите их на 12-луночную пластину, тщательно пипетировав их режущим наконечником объемом 200 мкл или используя инокуляторную петлю объемом 1 мкл. Поместите энтероиды в отдельные лунки, если необходимо провести окрашивание различными антителами. Удалите как можно больше жидкости кончиком объемом 200 мкл, не нарушая энтероиды. Добавьте 0,5 мл 4% PFA и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Время от времени закручивайте пластину, чтобы облегчить отслоение энтероидов от матрицы базальной мембраны. Исследуют грубо, чтобы определить отслоение энтероидов от матрицы базальной мембраны. Осторожно аспирируйте и выбросьте жидкий PFA, не нарушая энтероиды. Промывка с PBS 3x для удаления PFA и любой остаточной матрицы базальной мембраныПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация жидкости под стереомикроскопом может быть полезна для предотвращения энтероидов. Фиксированные энтероиды могут храниться в PBS при 4 °C до 1 месяца. БлокировкаОсторожно удалите остатки PBS пипеткой 200 мкл, не нарушая энтероиды. Добавить 0,5 мл блокирующего буфера и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Извлеките и выбросьте блокирующий буфер с помощью пипетки 200 мкл, стараясь избежать нарушения энтероидов. Окрашивание антителамиДобавьте 500 мкл первичного антитела в блокирующий буфер к каждой лунке с энтероидами. Для первичных антител и для лизоцима коэффициент разбавления равен 1:100, для CDX2 коэффициент разбавления равен 1:100, а для виллина коэффициент разбавления равен 1:50. Инкубировать при 4 °C в течение ночи. На следующий день удалите раствор антител и промыть 3 раза PBS. Подождите 10-15 минут инкубационного времени для каждой стирки. Повторите шаги 4.3.1.-4.3.2. для вторичного антитела с коэффициентом разведения 1:400. Добавьте 500 мкл DAPI при 5 мкг/мл в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации промыть 3 раза PBS и дать 10-15 минут инкубационного времени для каждой промывки УстановкаУдалите как можно больше PBS. Промыть окрашенные энтероиды 70% глицерином 1x. Поднимите энтероиды из пластины с помощью инокуляционной петли объемом 1 мкл или разрезанного наконечника объемом 200 мкл и установите с 70% глицерином на предметное стекло микроскопа. Чтобы сохранить 3D-структуру энтероидов, обеспечьте пространство 0,5-1 мм между нижним стеклянным слайдом и крышкой. Используйте вырезы из тонкого силиконового резинового листа или стеклянной крышки, чтобы создать пространство между стеклянной горкой и крышкой. Энтероиды теперь можно визуализировать с помощью конфокального микроскопа. 5. Подготовка к микроинъекции энтероидов ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол микроинъекции является модифицированным протоколом от Hill et al.16 в соответствии с ресурсами и настройками. Некоторые из подготовительных шагов должны быть завершены за несколько дней. Настройка микроинъекционной установкиУстановите микроинжекторный аппарат либо внутри шкафа биобезопасности, либо на чистый счетчик, в зависимости от цели экспериментов, следующим образом: стереомикроскоп для просмотра, микроманипулятор с регулятором осей X,Y и Z, установленный на тяжелой подставке рядом с микроскопом, держатель микропипетки, установленный на кронштейне микроманипулятора, трубка микроинжектора, соединяющая держатель микропипетки, и шприц с трехсторонним запорным краном, затем к пневматическому насосу и настенному источнику воздуха, подключенному к насосу (рисунок 1). Дезинфицируйте микроинъекционный аппарат 70% этанолом перед экспериментальным использованием и после него. Проверьте позиционирование микроскопа и микроманипулятора в соответствии с желаемыми физическими характеристиками, включая перемещение осевых ручек, чтобы микропипетка могла достичь целевого образца. Приготовление микропипеткиПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти действия заранее.Используйте съемник микропипетки, чтобы втянуть стеклянные капиллярные трубки в микропипетки. Под стереомикроскопом поместите микропипетку на горизонтальный держатель микропипетки (рисунок 2), сосредоточьтесь на наконечниках и вырежьте наконечники с помощью микроножников, глядя через окуляры микроскопа. Подготовьте около 10-15 микропипеток с одинаковым размером наконечника для каждого эксперимента. Проверьте размер наконечника, подтянув 0,5-1 мкл жидкости, и посчитайте, сколько насосов необходимо для опорожнения объема. Протестируйте несколько размеров наконечников, чтобы найти подходящий размер для эксперимента. Соответствующий размер наконечника выбрасывает примерно 10-30 нЛ объема на насос. Храните нарезанные стеклянные микропипетты в чистой коробке или трубке, не повреждая наконечники.ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нарезанные микропипетты доступны в продаже. Энтероидная подготовкаПоместите на лед пластину, состоящую в основном из крупных и сферических энтероидов. Замените старую питательную среду свежей. Осторожно отделите точки матрицы базальной мембраны от пластины с помощью клеточного лифтера. Закрутите гелевые точки из стороны в сторону на льду, чтобы разрушить матрицу базальной мембраны, не нарушая энтероиды. Выберите около 10-15 сферических энтероидов с вырезанным наконечником пипетки 20 мкл под стереомикроскопом и добавьте к матрице базальной мембраны, чтобы получить 285 мкл смеси белковой концентрации 8 мг / мл. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз с помощью разрезанного наконечника объемом 200 мкл, чтобы смешать энтероиды, не ломая их. Пластина пяти 50 мкл гелевых точек в центре круглой чашки 35 мм х 10 мм для культуры клеток Петри или одной с аналогичными размерами. Инкубировать энтероидные гелевые точки при 37 °C в течение 10 мин для затвердевания. Затем добавьте в блюдо 1 мл свежей питательной среды. Инкубируют энтероиды в течение не менее 2-3 дней для стабилизации и до тех пор, пока энтероиды не достигнут соответствующего размера 0,5-1 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь блюдо с низкой стенкой для более легкого доступа к энтероидам и небольшим диаметром для меньшего объема питательной среды. Микроинъекция декстран-ФИТЦ и испытуемого материалаВыключите трехсторонний запорный кран на пневматический насос. Заполните микропипетку введенным материалом, в данном случае декстран-ФИТЦ с ЛПС или без него. Приготовьте чашку Петри, покрытую полоской прозрачной пленки. Поместите на пленку две-четыре точки введенного материала по 1 мкл. Используйте микроманипулятор, чтобы загнать наконечник микропипетки прямо внутрь жидкости, но над пленкой под визуализацией стереомикроскопа. Осторожно потяните за шприц, чтобы вывести введенный материал в микропипетку. Наполните микропипетку 2-4 мкл введенного материала и надавите на шприц, чтобы удалить любой воздух на кончике микропипетки. Осмотрите колонку впрыскиваемого материала в микропипетке, чтобы убедиться, что в ней нет воздушного кармана. Запишите объем вводимого материала, который выводился внутрь микропипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость видна в зеленоватом цвете благодаря декстран-ФИТК. Включите источник воздуха, подключенный к пневматическому насосу, который обеспечивает давление воздуха примерно 60 фунтов на квадратный дюйм. Включите насос и установите длительность насоса на 10-15 мс. Поверните запорный кран на шприце, чтобы открыть линию от насоса до микропипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Большая продолжительность насоса позволяет выделять больше материала на насос. Для оценки объема впрыска рекомендуется использовать одинаковую продолжительность насоса и микропипетты с одинаковыми размерами наконечников. Удалите энтероиды из инкубатора клеточной культуры и поместите посуду поверх теплого пенопластового кирпича в закрытый контейнер, чтобы ограничить воздействие света после микроинъекции. Поместите чашку Петри с энтероидами под стереомикроскоп и переместите ручки микроманипулятора, чтобы поместить наконечник микропипетки под углом около 35°-45° к горизонтальной поверхности (рисунок 3). Это требует некоторой практики заранее. Визуализируйте и нанесите на карту энтероиды в каждой чашке Петри под микроскопом, чтобы составить план введения около 3-5 сферических энтероидов на чашку. Как только кончик микропипетки приблизится к поверхности жидкости, посмотрите в окуляры микроскопа, чтобы продвинуть наконечник к целевому энтероиду. Проколите энтероид кончиком микропипетки, продвигая ручку оси Z точным медленным движением. Энтероидная стенка будет сжиматься и выскакивать назад, как только наконечник проходит через энтероидную поверхность, и в этот момент продвижение должно прекратиться. Нажмите на педаль насоса одной ногой и заполните энтероид зеленоватым раствором декстран-FITC до тех пор, пока он не будет слегка расширен. Запишите количество насосов, чтобы рассчитать перекачиваемый объем и концентрацию декстрана. Извлеките кончик микропипетки после завершения микроинъекции и перейдите к следующему энтероиду. С практикой процесс может пройти гладко.Если наконечник сломался, замените его другой микропипеткой с аналогичным размером наконечника. Вытяните достаточный объем вводимого материала для всех энтероидов в одной группе воздействия и измените микропипетку между вводимыми материалами, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Поместите введенное энтероидное блюдо под крышку, чтобы избежать воздействия света. Сбор и измерение Декстран-ФИТЦПосле процедуры микроинъекции немедленно удалить культуральную среду. Промыть свежей питательной средой 2x, чтобы удалить остатки декстран-FITC. Добавьте свежие носители и запишите время как время 0 после микроинъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Вам может понадобиться второй человек, чтобы выполнить этот шаг, не нарушая процесс микроинъекции. Собрать 200 мкл культуральной среды в непрозрачной микрофузионной трубке объемом 0,5 мл, а затем заменить удаленную культуральную среду тем же объемом свежей питательной среды через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч и 12 ч после микроинъекций.ПРИМЕЧАНИЕ: Временной интервал может варьироваться в зависимости от эксперимента. При базолатеральном воздействии замещающие среды должны содержать экспозицию в той же концентрации. Хранят собранные питательные среды при 4 °C и измеряют концентрацию декстрана в течение 24 ч. Храните остатки среды при температуре −80 °C для других анализов. В конце сбора питательных сред собирают энтероиды для экстракции РНК или визуализации, если это необходимо. Измерьте концентрации декстран-ФИТК с помощью флуоресцентного микропластичного считывателя. Постройте стандартную кривую для каждой пластины, используя последовательные разбавления и установив линию линейной регрессии, как показано на рисунке 4. Корректировать абсорбцию для удаленного объема культуральной среды, содержащей декстран, которая была заменена свежей питательной средой без декстрана, следующим образом: удаление 200 мкл из 2 мл культуральной среды составляет 10% по объему.Скорректированное поглощение через 2 ч = (поглощение при 1 ч х 10%) + измеренное поглощение через 2 чПоглощение первой скорректированной среды не нуждается в коррекции. Затем рассчитайте концентрацию декстрана из скорректированного значения поглощения, используя стандартное уравнение кривой. Для нормализации разделите концентрацию декстрана на общее количество насосов для каждой чашки Петри, а затем умножьте на наибольшее общее количество насосов на чашку.ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспозиции проводятся в трех экземплярах (три чашки Петри на экспозицию с 3-5 микроинъективами на чашку). Средние значения трипликатов сравниваются между экспозициями с помощью t-теста Студента.