调查低成本方法，以测量秀丽隐杆线虫的寿命和健康寿命

1. 秀丽隐杆线虫的生长和维持 浇注线虫生长培养基 （NGM） 板在标准2%琼脂平板上生长 秀丽隐杆线虫 生长，线虫生长培养基（NGM），由1 mM CaCl2，5μg/ mL胆固醇，25 mM KPO4 （pH 6.0），1 mM MgSO4，0.25%w / v肽酮和51.3 mM NaCl组成。 对于1LNG琼脂平板，将2.5g蛋白胨，3.0gNaCl和20g琼脂量量入1 L烧瓶中，并用搅拌棒。注意：建议对特定的琼脂来源进行标准化，因为我们已经看到品牌之间刚度的变化，这可能会影响可重复性。在这里，严格使用白细胞琼脂。此外，建议将琼脂直接加入到被高压灭菌的烧瓶中，因为琼脂在没有加热的情况下不会完全溶解，并且转移含有琼脂的溶液会导致琼脂的损失和浓度错误。 添加 dH2O 至 970 mL。注意：灭菌后30 mL液体添加剂将使最终体积达到1 L。在我们的手中，需要约951毫升dH2O才能达到970毫升的最终体积。 使用标准高压灭菌器或培养基灭菌器对NGM琼脂溶液进行灭菌，以实现高效灭菌。注意：此时，无菌NGM琼脂可以在室温下储存数月。如果储存，NGM-琼脂可以在具有15-45 s脉冲的微波炉中重新提振，以防止溶液沸腾，或在热水浴中。 让溶液搅拌，直到冷却至60-75°C。 冷却时搅拌对于防止冷却不均匀非常重要，这可能会导致一些琼脂凝固。 当溶液冷却时，将水浴或珠浴加热至65-70°C。 一旦溶液冷却至60-75°C，加入液体添加剂：2.0 mL 0.5 M CaCl2，1 mL 5mg / mL胆固醇，25 mL 1 M KPO4 （pH 6.0）和0.5 M MgSO4（参见 表1 了解所有试剂的配方），并让溶液混合约5分钟以确保完全混合。注意：药物也可以包含在这里的平板中（例如，加入 1 mL 100 mg/mL 羧苄青霉素和 1 mL 1 M IPTG，加入 10 mL 2.5 mg/mL 长尼卡霉素，加入 10 mL 400 mM 百草枯）。 将含有NGM-琼脂的浸没式烧瓶放入65-70°C水浴中，以防止NGM琼脂在倒入板中时凝固。 将9-11 mL溶液移入每个60 mm板中，或将20-30 mL溶液移入每个100 mm板中。注意：建议使用最小的移液器体积，以避免移液器中空气膨胀引起的NGM泄漏。移液比添加到每个板中的培养基多1-2 mL，以避免完全排空移液器，这将有助于防止气泡形成。或者，可以将培养板直接从瓶子中手动倒入板中，但强烈建议移液以确保板具有相等的体积。当使用将溶液直接施加在板顶部的方法时，等体积的板对于确保相似浓度的溶液非常重要（参见步骤1.1.17）。相等的体积还允许轻松的显微镜检查在板之间保持相似的焦平面。 将移液器放回加热的溶液中以保持温度并防止NGM琼脂凝固。 对所有板重复上述两个步骤。 让NGM琼脂平板凝固过夜。 板固化后，将板在4°C下储存长达3个月，或继续步骤1.1.14以接种带有细菌的板。将印版存放在密封的容器中，以帮助保持水分以保持印版质量。 在环境温度（~22-25°C）下，在溶血肉汤（LB）或选择的等效培养基中培养24-48小时培养OP50，或在LB +抗生素中培养HT115（推荐氨苄西林/碳水化合物+四环素用于HT115），并在37°C下振荡12-16小时。注意：建议在室温下生长OP50，因为在37°C时发现了OP50的更具侵略性的生长，这会影响 秀丽隐杆线虫的 寿命。相比之下，HT115的生长速度较慢，培养密度较低;因此，建议在37°C下摇动HT115。 将体积为100-200μL的饱和OP50 / HT115培养物接种到60 mm平板上，或将1 mL用于100 mm板。 让盘子在台面上干燥一夜，如果盘子仍然潮湿，则允许额外的一天干燥。将板储存在4°C的密封容器中约2个月。 可选：将药物直接添加到接种的NGM琼脂平板上（例如，100μL 10mg / mL FUDR溶液）以对蠕虫进行化学灭菌。 维持秀丽隐杆线虫种群正确标记种子NGM琼脂平板的底部。在板底部的边缘贴上标签，以防止阻碍光线在标准解剖显微镜上的通过。 使用标准解剖显微镜，将所选细菌舀到 秀丽隐杆线虫 身上。注意：在该协议中，使用了由连接到玻璃巴斯德移液器末端的90%/10%铂/铱丝组成的镐线的镐头。 使用细菌，收集10-20个卵，L1，L2或L3动物，并将它们转移到新标记的种子NGM琼脂平板上。注意：最好收集年幼的动物;根据作者的经验，对于标准的野生型动物，移动10-20个卵/幼年动物将允许板在15°C下生长而不会挨饿。对于繁殖力下降的转基因或突变动物，应将更多动物移入板中。 对于具有野生型繁殖力并在15°C下生长的动物，每7天重复步骤1.2.1-1.2.3以保持每周库存。对于在20°C下生长的动物，每4-5天重复步骤1.2.1-1.2.3以防止饥饿。 同步蠕虫 via 漂白注意：一个完整的60毫米NGM琼脂板（例如，在15°C下生长的1周龄的储备板）将为所描述的大多数标准测定提供足够数量的动物。一般来说，一个成年（满是鸡蛋的成年人）会提供10-15个鸡蛋。42，一个完整的60毫米NGM琼脂板有100-200个妊娠成虫，提供约1000-2000个卵。对于需要更多动物的更大规模的实验，将一个完整的60毫米NGM-琼脂切成四到六个相等的碎片，并将它们切块到100毫米的接种板上以进行膨胀。注意：在这里，分块是指切割含有蠕虫的NGM琼脂板的一块，并将整个琼脂+蠕虫块移动到新板上，蠕虫面向下以使蠕虫爬到新板上。作为参考框架，具有野生型繁殖力的动物如果在分块后在20°C下生长2-3天，将产生完整的100毫米板。 要开始收集线虫，将少量M9溶液（表1）倒入含有蠕虫的平板上，注意不要过量填充培养皿。轻轻旋转M9溶液，使细菌草坪上的蠕虫松动。 用血清学移液器收集妊娠成虫，注意不要用移液器尖端刺穿琼脂。注意：建议使用玻璃血清移液器，因为 秀丽隐杆线虫 倾向于粘附在塑料上。如果没有玻璃移液器，建议从比所需数量更多的动物开始，因为有些动物会因为粘在塑料移液器上而丢失。 通过以1，100 x g 离心30秒来沉淀动物。吸出上清液。注意： 秀丽隐杆线虫 颗粒非常松散，因此在吸出上清液时请注意不要摇晃或破坏颗粒。 当动物离心时，每个菌株准备5 mL漂白溶液（有关配方详细信息，请参见 表1 ）;对于 5 mL 溶液，混合 1.5 mL 6% 次氯酸钠（漂白剂）、0.75 mL 5 M NaOH 或 KOH 和 2.75 mL dH2O。注意：次氯酸钠和高浓度氢氧化物溶液具有腐蚀性，因此建议在处理时戴上手套和实验室外套。 向蠕虫颗粒/ M9混合物中加入5 mL漂白溶液。 每隔几分钟在解剖显微镜下检查蠕虫，直到所有成虫体都溶解，混合物中只剩下卵。用力摇动蠕虫/漂白剂混合物，以加快漂白过程。注意：将鸡蛋长时间留在漂白剂混合物中会导致鸡蛋损坏，并会影响动物的生存能力。对于野生型动物，漂白通常需要4-6分钟，摇晃。因此，建议从4分钟标记开始，每隔30秒在显微镜下检查动物。 通过将鸡蛋/漂白剂混合物以1，100 x g 旋转30秒来沉淀鸡蛋。注意：一些 15 mL 锥形管在管内侧有梯度线。对于这些管子，建议以更高的速度旋转鸡蛋（例如，在2，000 x g下旋转30 秒），以确保鸡蛋沉淀到管的底部并且不会保持在梯度线上。 吸出漂白溶液。注意：卵颗粒比蠕虫颗粒更硬，但仍然很容易被破坏。因此，请注意离心后不要摇晃管子。 通过添加高达15 mL的M9溶液并将管倒置四到五次来洗涤鸡蛋，以确保鸡蛋完全分散在M9溶液中。 通过以1，100× g 离心30秒来沉淀鸡蛋，并吸出M9溶液。 重复上述两个步骤，总共洗涤四次，以消除鸡蛋混合物中的任何漂白剂。 最终洗涤后，将卵重悬于100μL至2mL的M9溶液中（即，取决于漂白的蠕虫总数）。彻底摇晃鸡蛋以分解团块，并确保颗粒完全重悬。 或者，动物可以被L1阻止以进行更紧密的时间同步;对于L1阻滞，在15 mL锥形管中将M9溶液加入蛋丸中至〜10 mL。让蠕虫在旋转器中在20°C或环境温度下旋转长达24小时。L1动物通常比步骤1.3.16中描述的卵时间少半天即可成年。 通过将4μL鸡蛋/ M9混合物移液到接种有细菌的NGM板上来近似卵子浓度（或L1浓度，参见步骤1.3.14）。计数并计算每个μL电镀中存在多少个卵子。重复计数三到四次以改善近似值。注意：近似鸡蛋浓度将确保将足够的动物接种到适当的样品量用于实验，而不会过度电镀，这将导致饥饿。 根据近似值，将适当数量的卵铺在接种了所选细菌的NGM琼脂平板上。对于OP50板，在60 mm板上最多接板200只动物，在100 mm板上接板最多1，000只动物。对于HT115板，在60毫米板上最多接板150只动物，在100毫米板上接盘600只动物。注意：这些是基于我们实验室条件的近似数字，数字可能会根据细菌草坪的厚度而变化。在15°C下生长的卵需要〜5天才能达到成年期的第1天（〜140小时才能达到产卵最大值，妊娠成虫阶段）。在20°C下生长的卵需要〜4天才能达到成年期的第1天（〜96小时才能达到产卵最大值，妊娠成虫阶段）。在25°C下生长的卵需要约3.5天才能达到成年期的第1天（约62小时才能达到产卵最大，妊娠成虫阶段）。 产卵作为同步 秀丽隐杆线虫 种群的替代方法如果漂白方案不可行（例如，没有可用的离心机），作为同步 秀丽隐杆线虫种群的替代方法，请执行产卵程序。请记住，该协议更加劳动密集型，将导致动物产量降低。 对于产卵，将8-12个妊娠成虫放在接种有所选细菌的标准NGM-琼脂平板上，并记录放置在板上的确切数量的动物。注意：蛋产程序应在将用于实验的温度下进行。 让动物产卵4-8小时。注意：动物留在盘子上的持续时间可以在需要时进行调整。例如，当可用时间较少时，可以将大量动物放在盘子上以缩短产卵时间。 秀丽隐杆线虫 通常成群结队地产卵，对于野生型繁殖力为43的动物，可以估计出大约5个卵/小时的速度。遵循步骤1.3.16中的建议，以避免过度电镀动物。 从盘子里取出所有成年动物。注意：留在盘子上的任何成年动物将继续产卵，导致种群不同步。 将卵置于15°C下约5天或20°C下约4天，以达到第1天成年期。 2. 测量秀丽隐杆线虫的寿命 标准使用寿命通过用100μL所选细菌接种板来制备NGM琼脂平板。为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。由于蠕虫在成年期的产卵阶段每天移动，因此在生命周期内播种五到七组NGM琼脂平板，每个菌株两到四个板将动物生长到成年期（即，如果使用8个15只动物的板，则需要在每个条件下播种40-56个板）。 让盘子干燥过夜后再储存。注意：建议将板储存在4°C，并且每天从冷库中取出所需数量的板，以防止细菌形成厚厚的草坪，使移动/计算寿命变得困难。确保在电镀蠕虫之前加热板。 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准寿命，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。注意：在目前的病例中，对于大多数研究人员来说，10-15只动物是一个可控的数字，尽管六盘20只动物也可以降低消耗品的成本。 在最初的7-8天或直到后代不再可见，每1-2天将成年动物移离其后代。注意：动物可以每隔一天移动一次以保存材料，但必须注意确保卵/幼虫动物不会与成虫一起转移，以防止成虫与后代一起污染。在这项研究中，最简单的方法是每天从产卵量达到最大值的第1-3天移动动物，然后在产卵最少的第5-8天切换到每隔一天移动一次动物。使用这种方法，在第1-3天防止卵/幼虫动物的转移并不是必须的，因为成虫每天都会移动，卵/幼虫不能在1天内发育到成年期。 在动物停止产生后代后，每隔一天对寿命进行评分，直到所有动物都被计为死亡或被审查。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。注意：死亡被计为动物，当用镐头轻轻触摸时，它们不会表现出任何动作。审查被计为袋装的动物，表现出外阴/肠道突起，或爬到干燥的板的侧面。 使用 FUDR 进行化学灭菌的使用寿命通过用100μL所选细菌接种板来制备NGM琼脂平板。为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种8-12个板用于寿命实验，每个菌株播种2-4个板以将动物生长到成年期。让盘子干燥过夜。 将100μL10mg / mL FUDR加入细菌草坪中间，用于8-12个板，用于寿命测定。记住要留下两到四个没有FUDR的盘子作为起始板，让动物长大成人。让盘子干燥过夜。注意：FUDR会阻断DNA合成，因此建议在处理时戴手套。 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。注意：这些动物需要在没有FUDR的盘子上生长，因为FUDR会导致动物被捕/死亡。 将10-15天1成年动物移动到8-12个含有FUDR的盘子上。对于标准寿命，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。注意：如果必须完全避免后代形成，动物也可以在L4阶段移动到FUDR上，但动物不能过早移动，因为这会导致动物面临更高的外阴/肠道突起风险，并会增加审查。 每隔一天对寿命进行评分，直到所有动物都被记为死亡或被审查。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。注意：对于FUDR寿命，任何后代都可以被忽略，因为它们会在L1阶段被捕并最终死亡。 使用温度敏感型无菌突变体的寿命通过用100μL所选细菌接种板来制备NGM琼脂平板。为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种8-12个板用于寿命实验，每个菌株2-4个板用于将动物生长到成年。让盘子干燥过夜。 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。请记住在25°C的限制性温度下生长动物，以确保动物不育。 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准寿命，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。 每隔一天对寿命进行评分，直到所有动物都被记为死亡或被审查。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。注意：在处理短寿命应变时，建议每天对寿命进行评分，因为在25°C下的寿命要短得多，因此动态范围有限。根据作者的经验，动物可以在第2天后移回20°C，如果最好在20°C下得分寿命，动物将保持不育状态。 3. 测量秀丽隐杆线虫的健康寿命 通过撞击测量运动行为使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。 将第1天成虫的小菌落移动到解剖镜下的NGM-琼脂平板上，到10-20μLM9溶液上。建议将10-15只动物作为可管理的动物数量来计数。 一次聚焦一条蠕虫，计算样本在15秒内从凹形变为凸形的次数。使用手动计数器和计时器，以便在测定期间将焦点放在蠕虫上。注意：可以录制板的视频，以便进行更彻底/更轻松的分析。例如，大多数智能手机和数码相机（15-30美元）都可以使用标准显微镜目镜附件，这些都是以低成本进行视频打击的绝佳选择。 对液体中的其他蠕虫重复步骤3.1.3，平均10-15个蠕虫的总运动速率。对于较高的样本数量，请重复步骤 3.1.2-3.1.4。 将蠕虫老化到所需的年龄。步骤2.1-2.3中描述的类似的寿命测定方法可用于老化蠕虫。重复步骤3.1.2-3.1.4以测定所需年龄的暴击。注意：步骤3.1.2的替代方法是将〜30μL或更多的M9溶液加入板上的一组蠕虫上。这将节省手动转移蠕虫的时间，尽管由于蠕虫在单个板上的位置随机发生，因此不能保证一组蠕虫将保持在板上的单个点。 秀丽隐杆线虫繁殖力（卵数）的测量 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。卵子计数的测定从L4阶段开始，即第1天成年期前约1天（L1被捕后在15°C下约3天或在20°C下约2天）。 将L4蠕虫单挑到单独的NGM琼脂平板上，接种有选择的细菌。建议使用约10-15只动物进行繁殖力测定。注意：建议将所选细菌稀释50%（即，不是饱和培养物），以提高鸡蛋在细菌草坪中的可见度。 让动物在20°C下生长过夜。 确保新播种的一批盘子已准备好第二天。 在成年期的第1天，将成虫转移到接种有所选稀释细菌的新鲜NGM琼脂平板上。注意：建议使用新鲜播种的板，或将板储存在4°C直至使用，以防止厚厚的细菌草坪。 计算每个NGM琼脂平板上产卵的总数。注意：为了帮助扫描板，可以在板的盖子上绘制一个网格，并将其放置在正在划定鸡蛋的板下方。然后可以沿着网格线扫描板，以保持板移动时的方向，并防止任何鸡蛋的重计数。 重复步骤3.2.4-3.2.57-8天或直到鸡蛋在盘子上不再可见。注意：对于产卵率高的第1-3天，建议至少每12小时移动一次动物，并每天测定两次卵计数。然而，这增加了消耗品的工作量和成本，因此移动动物和测量可以限制为每天一次，但必须注意确保所有卵和孵化的动物都正确计数。出于该测定的目的，任何孵化的动物都算作卵。 测量秀丽隐杆线虫后代的育雏大小（发育）使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。育雏大小的测定从L4阶段开始，即成年期第1天前约1天（L1停滞后在15°C下约3天或在20°C下约2天）。 将L4蠕虫单挑到单独的NGM琼脂平板上，接种有选择的细菌。建议使用约10-15只动物进行繁殖力测定。 让动物在20°C下生长过夜。 确保新播种的一批盘子已准备好第二天。 在成年期的第1天，将成虫转移到接种有所选细菌的新鲜NGM琼脂平板上。 每12-24小时（每天2次或每天1次），将成虫转移到用所选细菌播种7-8天的新鲜NGM琼脂平板上或直到后代不再可见。将所有装有鸡蛋的盘子保持在20°C。 重复步骤3.3.57-8天或直到后代不再可见。将所有装有鸡蛋的盘子保持在20°C。注意：后代板也可以储存在15°C，以延长需要评分之前的时间。 转移蠕虫两天后，在板上计数发育的后代。在L4阶段（即在20°C下孵化后2天）或更早地计数发育中的蠕虫，以确保F2生成（即后代的后代）不会混淆结果。数一数所有活着的蠕虫。在计数时从板中取出所有蠕虫。在再次对板进行评分之前，将板再维护1-2天，以确保不会错过任何孵化/发育延迟的动物。 对收集的每个蛋底板重复步骤3.3.7。注意：育雏尺寸测定可以与卵计数测定（步骤3.2）一起进行，通过从一个实验中收集两组数据，最大限度地减少劳动力和消耗品成本。这也将允许直接比较同一动物内的育雏大小和卵数。 4. 测量秀丽隐杆线虫的应力弹性 使用尤尼卡霉素测量ER应激敏感性通过将含有长尾草霉素的板（参见步骤1.1.7，注）与100μL所选细菌的接种板来制备NGM琼脂平板。注意：处理长春霉素时应戴手套。 为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种8-12个表尼卡霉素板用于生存测定，每个菌株2-4个没有长尼卡霉素的板，用于将动物生长到成年期。让盘子干燥过夜。 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。注意：动物必须在没有长春花霉素的培养皿上生长，直到成年期的第1天，因为动物会因长尼卡霉素而被捕/死亡。 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准生存测定，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。注意：与FUDR测定类似，长尼卡霉素存活测定可以在不移动动物的情况下进行，因为长尼卡霉素会导致L1动物死亡/停滞。然而，当进行DMSO对照时，后代将在DMSO板上发育，因此动物需要每天移动或需要灭菌技术（第2节中用于寿命的相同方法可用于生存测定）。 生存测定的评分与寿命相似。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。注意：虽然可以每隔一天对动物进行一次评分，但由于长春霉素死亡迅速发生，因此建议每天对生存测定进行评分。 使用百草枯测量线粒体/氧化应激敏感性通过播种含有百草枯的板来制备NGM琼脂平板（见步骤1.1.7;注）含有 100 μL 自选细菌。注意：处理百草枯时应戴上手套，因为百草枯会对环境造成危害。请与机构的环境健康和安全部门核实丢弃要求，因为许多研究机构将要求对环境危害进行特定的丢弃说明。 为了保持一致性，请确保在所有重复中使用相同的细菌。每个菌株播种 8-12 个板用于生存测定，每个菌株播种 2 到 4 个不含百草枯的板，用于将动物生长到成年期。让盘子干燥过夜。 使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。注意：切记在不含百草枯的盘子上生长动物，直到成年期的第 1 天。然而，有必要采用绝育技术或让成虫远离后代，因为有些动物可以在百草枯板上发育到成年期（参见步骤 2.2-2.3）。 将10-15天1成年动物移动到每个8-12个盘子上。对于标准生存测定，从~120只动物开始，以确保样本量在审查事件发生后不会下降到100以下（例如，15只动物的8个板= 120个动物，12个10个动物的12个板= 120个动物）。 生存测定的评分与寿命相似。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。注意：虽然可以每隔一天对动物进行一次评分，但由于使用百草枯会迅速死亡，因此建议每天对生存检测结果进行评分。当使用在25°C下生长的 glp-4（bn2） 动物时尤其如此，因为死亡将非常迅速地发生。 使用高温测量热应力敏感性（耐热性）使用步骤1.3和1.4中描述的标准漂白测定法收集 秀丽隐杆线虫 的同步群体。 通过将板放入37°C培养箱中至少1小时，将动物移动到板上之前，将NGM琼脂板预热至37°C。 将10-15天1成年动物移动到四到六个预热的盘子上。对于标准耐热性，从~60只动物开始（例如，15只动物的4个板= 60个动物，10个动物的6个板= 60个动物） 将动物放入37°C培养箱中，每2小时进行死亡评分。死亡被定义为在用镐头轻轻触摸时不表现出任何运动的动物。从盘子中取出所有死亡或被审查的动物，以避免混淆和叙述同一只动物。 确保在尽可能短的时间内从37°C培养箱中取出板，因为在划线时长时间在环境温度下放置的板会改变耐热性结果。注意：建议一次只拉出一个菌株进行评分，因为琼脂的温度在对一个菌株进行评分所需的时间内不会发生巨大变化。 中值耐热性通常在7-9小时内完成;因此，确保在7小时，9小时和11小时进行适当的测定。注意：虽然可以跳过1-5小时，但由于培养箱的可变性，板的厚度以及每个实验室中的其他混杂因素，如果计划跳过时间点，则在每个实验室中仔细滴定时间非常重要。有关耐热性的完整指南，请参见参考文献 44 。 或者，在34°C而不是37°C下进行耐热性测定。注意：34°C时的中值耐热性发生得很晚（本研究中为10-14小时），这允许在深夜（置于34°C培养箱中）制备耐热性测定，并在第二天早些时候开始评分。这允许约8小时的持续评分，而不是37°C耐热性测定所需的典型12小时周期。