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Quimica

Un enfoque microfluídico para el estudio de la cristalización de hidratos de hielo y clatrato

Published: August 18, 2022
doi:
10.3791/64072
,
1Department of Chemistry and Biochemistry,Yeshiva University, 2Department of Physics, Katz School of Science and Health,Yeshiva University

Summary

El presente protocolo describe la cristalización de cristales de hielo microscópicos e hidratos de clatrato en dispositivos microfluídicos, lo que permite el intercambio de líquidos alrededor de los cristales formados. Esto proporciona posibilidades sin precedentes para examinar el proceso de cristalización y los mecanismos de unión de los inhibidores.

Abstract

Una descripción mecanicista precisa de la cristalización del agua es un desafío y requiere algunos elementos clave: un excelente control de temperatura para permitir la formación de cristales microscópicos individuales y un sistema de microscopía adecuado acoplado a la etapa fría. El método descrito en este documento agrega otra característica importante que incluye el intercambio de soluciones alrededor del hielo y cristales de hidrato de clatrato. El sistema descrito comprende una combinación de instrumentos únicos y desarrollados en el hogar, que incluyen microfluídica, etapas frías de alta resolución y microscopía de fluorescencia. La etapa fría fue diseñada para dispositivos microfluídicos y permite la formación de cristales de hielo/hidrato de tamaño micrométrico dentro de los canales microfluídicos y el intercambio de soluciones a su alrededor. La resolución de temperatura y la estabilidad de la etapa fría es de un milikelvin, que es crucial para controlar el crecimiento de estos pequeños cristales. Este sistema diverso se utiliza para estudiar los diferentes procesos de cristalización de hielo e hidratos y el mecanismo por el cual se inhibe el crecimiento de estos cristales. El protocolo describe cómo preparar dispositivos microfluídicos, cómo cultivar y controlar cristales microscópicos en los canales microfluídicos, y cómo la utilización del flujo de líquidos alrededor de cristales de hielo / hidrato permite nuevos conocimientos sobre la cristalización del agua.

Introduction

Las proteínas anticongelantes (AFP) y las glicoproteínas anticongelantes (AFGP) protegen a varios organismos adaptados al frío de los daños causados por las heladas1. Las AFP y AFGP (generalizadas como AF(G)Ps) inhiben el crecimiento de cristales de hielo al unirse irreversiblemente a sus superficies e inhibir un mayor crecimiento debido al efecto Gibbs-Thomson 2,3,4,5. La brecha resultante que se forma entre la temperatura de fusión, que no cambia en gran medida, y la temperatura de congelación recién deprimida se llama histéresis térmica (TH) y representa un parámetro medible correspondiente a la actividad de AFP6. El uso de AFP para inhibir el crecimiento del hielo tiene aplicaciones de gran alcance y diversas, que ofrecen una mejora potencial en diversos campos, incluida la criopreservación, la calidad de los alimentos congelados y la protección de los cultivos expuestos al frío.

La cristalización del agua a bajas temperaturas y altas presiones en presencia de pequeñas moléculas orgánicas resulta en la formación de hidratos de clatrato (o hidratos de gas), donde el hidrato más abundante es el hidrato de metano7. La cristalización de hidratos de metano en las líneas de flujo de gas/petróleo puede causar tapones, que pueden causar explosiones debido a la ignición de gas 8,9,10. Los esfuerzos actuales para prevenir la cristalización de hidratos en las líneas de flujo incluyen el uso de inhibidores termodinámicos (alcoholes y glicoles) y cinéticos (principalmente polímeros)11,12,13,14. También se ha encontrado que las AFP se unen a los cristales de hidrato de clatrato e inhiben su crecimiento, lo que apunta al uso potencial de AFP para dificultar la formación de tapones, proporcionando así una solución más verde15.

La microfluídica es un método predominante utilizado para estudiar las propiedades de los fluidos en volúmenes de muestra minúsculos (hasta fL) que fluyen a través de una red de microcanales16. Los microcanales siguen un patrón creado en una oblea de silicio (el molde) utilizando litografía17. Un material comúnmente utilizado para fabricar dispositivos microfluídicos es el polidimetilsiloxano (PDMS), que es barato y relativamente fácil de trabajar en laboratorios de investigación. El diseño de las características (canales) se compone con respecto al propósito específico del dispositivo; por lo tanto, se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la detección de ADN18, el diagnóstico médico19 y los procesos de cristalización 3,20,21.

El presente protocolo describe un método microfluídico único para cultivar cristales de hielo e hidratos de tamaño micrométrico con varios inhibidores, incluidos AFP y AFGP. Para estos experimentos, se utilizaron hidratos de tetrahidrofurano (THF) para imitar las propiedades de los hidratos de gas metano22, que requieren equipos especializados para el control de presión y temperatura23. Se utilizaron AF(G)P marcados fluorescentemente para visualizar y analizar la adsorción de las proteínas a la superficie cristalina, y junto con imágenes fluorescentes, el enfoque microfluídico permitió la obtención de características clave del proceso de unión de estas moléculas a superficies cristalinas.

Protocol

1. Fabricación de dispositivos microfluídicos Cubra la superficie interior de una placa de Petri con papel de aluminio y coloque el molde preparado previamente en la placa de Petri.Fabricar los moldes utilizando las técnicas de litografía descritas en las referencias. Los dos diseños de dispositivos utilizados en el presente trabajo se representan en la Figura 1. Prepare 30-40 ml de la mezcla de PDMS pesando una mezcla 1:10 (en peso) del agente de curado y el elastómero (consulte la Tabla de materiales) y mezclando continuamente durante aproximadamente 5 minutos hasta que la mezcla aparezca blanca y casi opaca.NOTA: Coloque un vaso de plástico en la báscula, vierta el elastómero en la taza y luego agregue el agente de curado para lograr una relación de peso de 1:10. Vierta la mezcla de PDMS en la placa de Petri con el molde y desgasifique en un desecador hasta que no queden burbujas (aproximadamente 30 min). Hornear el molde con el líquido PDMS en un horno o en una placa caliente a 70 °C hasta obtener una consistencia similar al caucho. Este proceso dura aproximadamente una hora. Corte el dispositivo trazando las características con un bisturí, teniendo cuidado de empujar hacia adelante con el bisturí en lugar de hacia abajo, ya que el moho es frágil. Retire el dispositivo PDMS recortado y colóquelo boca abajo en una nueva placa de Petri. Elimine las partículas de polvo y suciedad de la superficie inferior colocando y retirando un trozo de cinta adhesiva (consulte la Tabla de materiales). Utilice una aguja de jeringa roma (20 G) para perforar agujeros en el dispositivo según el patrón impreso, utilizando un microscopio si es necesario. Asegúrese de que el orificio penetre por el otro lado del dispositivo y use pinzas para quitar las piezas perforadas. Lave bien un cubreobjetos (18 x 18 mm, 0,14 mm de grosor) con agua y jabón, y luego con isopropanol. Use presión de aire para secar el cubreobjetos limpio. Inserte el PDMS limpio y el cubreobjetos en el limpiador de plasma, cierre las válvulas y encienda la alimentación, la aspiradora y la bomba. Deje que el limpiador de plasma funcione durante aproximadamente un minuto, ajuste la RF a HI y permita que entre algo de aire en el limpiador de plasma con la válvula fina.Cuando el color de la ventana de visualización cambie de púrpura a rosa, deje que el limpiador de plasma funcione durante 50 s y apague la RF. Mantenga la bomba encendida durante un minuto y, después de apagarla, abra gradualmente la válvula principal para permitir que el aire entre en el limpiador de plasma.NOTA: Un método alternativo para lograr resultados comparables es la unión térmica. Para este método, coloque el molde en el cubreobjetos y colóquelo en una placa caliente a 70-80 ° C durante aproximadamente 60 minutos. Presione la superficie del PDMS sobre el cubreobjetos limpio y confirme que están unidos sin observar ningún desprendimiento al tirar ligeramente hacia arriba del cubreobjetos. Asegure la aguja de una aguja roma de 90° (18 G) con un par de alicates y tire del conector de la jeringa de plástico para extraerla. Inserte un extremo de la aguja en un tubo Tygon (0.020″ ID, 0.060″ OD, consulte la Tabla de materiales) y el otro extremo en uno de los orificios perforados del dispositivo. Repita el proceso para los otros agujeros. Para eliminar las burbujas de aire, inyecte agua/tampón en los canales con una jeringa de vidrio (una bomba es opcional, pero aquí no se usó ninguna bomba). Filtre todos los líquidos con un filtro de 0,22 μm antes de inyectarlos en el dispositivo. Use un agente bloqueador como una solución BSA al 1% para evitar la unión de AFP marcadas con fluorescencia en las paredes del PDMS. Inyecte el agente bloqueador en el canal de entrada y deje que permanezca en los microcanales durante 20 minutos. Luego, inyecte la solución tampón en el canal de entrada para eliminar la solución BSA.NOTA: El dispositivo PDMS resultante está conectado a un cubreobjetos a lo largo de su superficie inferior, conectado a un tubo en sus orificios de entrada y salida, y recubierto con un agente bloqueador en sus canales. 2. Configuración del dispositivo microfluídico Aplique una pequeña cantidad de aceite de inmersión en la superficie de la etapa fría de cobre (consulte la Tabla de materiales) y extiéndala con una toallita sin pelusa para crear una capa delgada de aceite. A continuación, coloque un disco de zafiro limpio (consulte la Tabla de materiales) en la capa de aceite creada. Aplique una gota de aceite de inmersión en el centro del disco de zafiro y coloque el dispositivo PDMS en la gota de modo que las características del dispositivo estén alineadas sobre el orificio de visualización de la etapa fría. Mantenga el dispositivo en su lugar y asegure el tubo a las paredes exteriores de la caja de aluminio que alberga la etapa fría con cinta adhesiva. Tome nota de la colocación de cada tubo específico. Use una jeringa de vidrio para inyectar 4-5 μL de solución AF(G)P (ver Tabla de materiales) en el canal de entrada. Cierre la tapa de la etapa fría.NOTA: La concentración de las soluciones de AFP puede variar y decidirse en función de su intensidad de fluorescencia. En el protocolo actual, el rango de concentraciones era de 5-40 μL. 3. Formación de monocristales en los canales microfluídicos Purgue la etapa fría con aire seco / nitrógeno para evitar que se forme condensación en su interior. Active un baño de enfriamiento circulante para hacer circular el agua a través de la etapa fría y servir como disipador de calor. Inicie el programa de control de temperatura y ajuste la temperatura a -25 °C.NOTA: La congelación ocurrirá a medida que la muestra alcance una temperatura de ~-20 ° C, que se puede observar como un oscurecimiento y rugosidad repentinos de la muestra. En este punto se puede utilizar cualquier objetivo, preferiblemente el objetivo 4x, que permite al usuario observar la totalidad de los canales microfluídicos. Lentamente, aumentando la temperatura en aproximadamente 1 °C/5 s, acercarse al punto de fusión de la muestra, que puede variar de -1 a -0,2 °C dependiendo del tampón utilizado en la solución AF(G)P. A medida que la temperatura se acerca al punto de fusión, espere hasta que se aíslen algunos cristales individuales.NOTA: Si es necesario, el hielo no deseado se puede derretir localmente usando un láser IR (980 nm) (consulte la Tabla de materiales), que se fija en el microscopio. El láser derrite los cristales de hielo cercanos mientras esté encendido. En este punto, se recomienda cambiar a objetivos 10x o 20x para observar mejor los cristales individuales. Después de obtener un solo cristal en la ubicación deseada, haga crecer el cristal disminuyendo ligeramente la temperatura (en ~ 0.01 ° C) hasta que los bordes del cristal se encuentren con las paredes del canal. Cambie al objetivo 50x, inyecte la solución AF (G) P en los canales y observe el aumento de la intensidad de fluorescencia, lo que indica que la solución de proteína se inyectó con éxito en los canales. Realice este paso con cuidado para evitar la fusión del cristal de hielo durante el intercambio de soluciones. Controle y ajuste de cerca tanto el caudal (aplicando más/menos presión sobre la jeringa de vidrio) como la temperatura durante el proceso de intercambio de la solución. Permita que las proteínas tengan tiempo suficiente para acumularse y unirse a la superficie del cristal.NOTA: Esto varía en función de las tasas de acumulación y adsorción del AF(G)P 5,25. En un experimento típico, se permiten 5-10 minutos para la acumulación de AFP 4. Medición de la actividad de histéresis térmica (TH) NOTA: Este paso es opcional. Determine el punto de fusión del cristal ajustando la temperatura con pequeños pasos de 0.002 ° C y observando la temperatura más alta a la que se puede someter un cristal pequeño sin que se derrita. En la función RAMP del controlador de temperatura, ajuste la velocidad de enfriamiento a -0.05 a -0.01 °C / 4 s y active la RAMPA. Tenga en cuenta la temperatura exacta a la que se produce el crecimiento repentino de cristales.NOTA: Este valor se denomina temperatura de explosión y corresponde a la temperatura de congelación. La diferencia entre las temperaturas de fusión y congelación es la actividad TH25. 5. Intercambio de soluciones alrededor de cristales individuales Asegúrese de que la temperatura de la muestra esté en el espacio TH para evitar la fusión o el crecimiento del cristal durante el experimento. Registre el proceso de intercambio de soluciones utilizando el programa de imágenes NIS Elements (consulte Tabla de materiales) para un análisis posterior de los datos de fluorescencia. Inyecte lentamente la solución tampón en la segunda entrada del dispositivo microfluídico y observe una disminución en la señal fluorescente a una velocidad que depende de la presión aplicada a la jeringa.Utilice esta representación visual para asegurarse de que la presión aplicada no sea demasiado alta para no hacer que el cristal se derrita. Consulte la figura 2 para obtener una secuencia de imágenes que muestran el proceso de intercambio de soluciones. Mida la intensidad de fluorescencia en el canal microfluídico utilizando el programa de imágenes.NOTA: La señal debe alcanzar su punto máximo en la región cercana a la superficie del cristal, lo que indica la unión de AFP, y debe ser relativamente baja en la solución circundante, que se ha lavado con tampón. Mida la actividad TH después del intercambio de soluciones siguiendo el paso 4. Repita el experimento aislando un nuevo cristal (pasos 3.3-3.5). Inyecte la solución de AFP con una jeringa de vidrio y repita el intercambio de la solución (pasos 5.1-5.3). Obtenga un nuevo monocristal (pasos 3.3-3.5) y haga fluir la solución de AFP hacia los canales utilizando la jeringa de vidrio. 6. Experimentos con hidratos de clatrato Para obtener hidratos de THF, prepare una solución THF/agua con una relación molar de 1:15, que es una relación de volumen de 1:3.326. Mantener esta relación en todas las soluciones utilizadas en los siguientes experimentos, incluidas las que contienen AF(G)Ps u otros inhibidores. Siga los pasos 1 y 2 para preparar el dispositivo microfluídico y colocarlo en la etapa fría. Ajuste la temperatura a -25 °C; la muestra se congelará a ~-20 °C como se describe en el paso 3.2. Después de congelar la solución de THF, aumente lentamente la temperatura hasta que todo el hielo se haya derretido.NOTA: El punto de fusión del hielo está ligeramente deprimido por el THF. Para asegurarse de que todos los cristales de hielo se derritan con exclusión de los hidratos, mantenga la temperatura a 1 °C durante 3 min. Ajuste la temperatura a -2 °C y observe la abundancia de hidratos que aparecen en los canales microfluídicos en ausencia de inhibidores.NOTA: Los hidratos de THF tienen forma de octaedros (Figura 2), y en algunos casos, los cristales son muy delgados; Por lo tanto, la observación clara puede ser un desafío. En estos casos, se recomienda repetir los pasos 6.4-6.5 para obtener nuevos cristales. Inyecte el inhibidor de AF(G)P/en el canal microfluídico utilizando la jeringa de vidrio mientras ajusta la temperatura para asegurarse de que los cristales obtenidos no se derritan/crezcan. Espere unos minutos para que las moléculas inhibidoras se adsorban a la superficie del cristal. Si es necesario, mida la actividad TH siguiendo el paso 4. Intercambie la solución alrededor de los cristales como se describe en los pasos 5.2-5.3.

Representative Results

Intercambio de solución con cristales de hieloUn intercambio de solución exitoso alrededor de un cristal de hielo se presenta en la Figura 3. La marca de tiempo en cada instantánea indica que el intercambio de soluciones fue relativamente rápido; Sin embargo, es posible un intercambio más lento. La intensidad de fluorescencia proveniente de las moléculas AFGP adsorbidas con hielo se observa claramente después de que se completa el intercambio (Figura 3, derecha). Un análisis cuantitativo de la concentración de AFP en la superficie del hielo se monitorea utilizando una herramienta de región de interés designada (ROI) (Figura 4). En este experimento4, se utilizó AFP tipo III (isoforma QAE) diluida en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,8) y 100 mM de NaCl. La solución se intercambia alrededor de un cristal de forma bipiramidal, y se monitorea la intensidad de fluorescencia en la solución y en el hielo. El gráfico rojo que indica la señal de fluorescencia en la solución se reduce en un factor de 100 durante el intercambio de solución, mientras que la señal calculada (gráfico verde) en la superficie del hielo permanece constante. La señal calculada de las moléculas adsorbidas por el hielo se obtuvo restando la señal proveniente de la solución (multiplicada por una constante que se relaciona con el espesor del canal microfluídico) de la señal proveniente del hielo4. Intercambio de soluciones con hidratos de THFLos experimentos microfluídicos con hidratos de THF se llevaron a cabo de manera similar a los experimentos con hielo. Después de que se permitió que los cristales de hidrato adsorbieran las moléculas inhibidoras de la solución, se inyectó una solución libre de inhibidores en los canales. La Figura 5 presenta hidratos de THF después del intercambio de solución con dos tipos de inhibidores: AFGP1-5 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 5A) y safranina O (ver Tabla de Materiales), que es un colorante fluorescente26 (Figura 5B). Esta es la primera demostración de un AFGP que se une a la superficie de un hidrato de clatrato. Figura 1: Representación esquemática de los canales microfluídicos utilizados en el presente estudio. Ambos diseños incluyen dos entradas y una salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Los hidratos de THF se formaron en el canal microfluídico después de que la temperatura se enfrió a ~-2 °C. La morfología de todos los cristales presentados es un tetraedro; Sin embargo, algunos cristales están orientados de manera diferente. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Un experimento representativo que exhibe intercambio de solución alrededor de un solo cristal de hielo en un canal microfluídico. Inicialmente, la solución contenía AFGP1-5 marcado con FITC, y no se observaron AFGP adsorbidos con hielo. Después de que la solución se cambió por una solución libre de AFGP, se detectaron claramente las proteínas que se habían adsorbido previamente a la superficie del hielo (imagen de la derecha). Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Un análisis cuantitativo y cualitativo de la concentración de AFP en la superficie del hielo. (A) Un cristal de hielo a alta concentración de solución de AFP (antes del intercambio de solución). (B) El mismo cristal después de que la solución de AFP se intercambió con una solución tampón libre de AFP. Barra de escala = 20 μm. (C) Análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia en la superficie del hielo (negro) y en la solución (rojo) durante un intercambio de solución. La curva verde representa la intensidad calculada en la superficie del hielo. La figura está adaptada con permiso de la referencia4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Cristales individuales de hidrato de THF en canales microfluídicos después de que se intercambió la solución alrededor de ellos (A, AFGP1-5) o (B,  Safranine O). La imagen de (B) se reproduce a partir de la referencia26. Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El presente protocolo fue diseñado para utilizar la combinación de flujo microfluídico con cristales microscópicos con el fin de revelar nuevos conocimientos sobre el crecimiento de cristales y su inhibición. Una etapa fría27 con temperatura controlada de resolución milikelvin permite el control de cristales microscópicos individuales situados dentro de canales microfluídicos, lo que permite el intercambio de soluciones a su alrededor. Si bien la fabricación de dispositivos microfluídicos es estándar y similar a las prácticas comunes17,18, el control sobre el crecimiento y la fusión de cristales dentro del dispositivo es único y novedoso. El componente más crítico en este sistema es el excelente control de temperatura, que se logra mediante el uso de enfriadores termoeléctricos Peltier, retroalimentación de un termistor que se encuentra cerca de la muestra y un controlador de temperatura de alta resolución que gobierna el circuito de retroalimentación.

Otro paso crítico es el intercambio de la solución en sí, ya que los cristales pueden derretirse o crecer durante este proceso; Por lo tanto, la temperatura debe ajustarse durante el intercambio de la solución para evitar el crecimiento / fusión. La formación de cristales en canales microfluídicos interfiere con el flujo de líquido y plantea el principal desafío de este sistema; Por lo tanto, el crecimiento de estos cristales debe ser controlado. Aquí, un láser IR (980 nm) fue montado en el microscopio invertido y fue utilizado para derretir localmente cristales de hielo/hidratos no deseados28. Si no se puede usar un láser de este tipo, los conectores metálicos del dispositivo microfluídico se pueden calentar mediante un enfriador termoeléctrico Peltier adicional, que derretirá el hielo en la entrada / salida del dispositivo.

El método descrito aquí incluye instrumentos desarrollados en casa (etapa fría) y requiere entrenamiento, ya que algunos de los pasos mencionados anteriormente son desafiantes. Como la concentración de la solución que rodea los cristales puede cambiar incluso cuando el flujo no está previsto, un simple paso de calibración5 puede proporcionar una estimación confiable de la concentración basada en la señal de fluorescencia. Otra posible solución al flujo no deseado (durante las mediciones TH, por ejemplo) son las válvulas microfluídicas, que se describen en la referencia4.

Este sistema también fue utilizado para explorar el comportamiento de crecimiento del hieloD2Oen el líquidoH2O, un estudio que reveló un nuevo fenómeno de superficies de hielo microscópicas festoneadas27. Por lo tanto, la microfluídica se puede utilizar en el estudio de varios sistemas cristalinos que responden bien a los cambios de temperatura.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Se agradece a los donantes del American Chemical Society Petroleum Research Fund por el apoyo a esta investigación (número de subvención 60191-UNI5). Los autores desean agradecer al Prof. Ido Braslavsky por ser pionero en el uso de dispositivos microfluídicos para estudiar las proteínas anticongelantes y el hielo. Los autores agradecen al Prof. Arthur DeVries, al Prof. Konrad Meister y al Prof. Peter Davies por proporcionar muestras de proteínas anticongelantes.

Materials

0.22-micron filters Fisher Scientific
90-degree bent blunt needles 18 Gauge
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins A gift See references 5 and 28
Blunt needles 18 Gauge and 20 Gauge
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich
Cold stage Home made
Cover slips Globe Scientific 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness
Glass syringe
Infrared laser 980 nm Opto Engine LLC
Inverted microscope, Eclipse Ti – S Nikon
Invisible tape Staples
lint-free wipe Kimwipes
Newport 3040 temperature controller Newport 3040
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Oil vacuum pump Harrick Plasma
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) Dow Corning Syglard
Safranine O Sigma-Aldrich S2255-25G
Sapphire disc Ted Pella Inc 16005-1010  25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness
sCMOS Camera, Neo 5.5 Andor
Tetrahydrofuran (THF) Sigma-Aldrich 401757-100ML
Tygon Microbore tubing for microfluidic device Cole-Parmer  0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll.
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas Cole-Parmer 1/8” ID, 3/16” OD
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Referencias

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Drori, R., Shalom, Y. A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization. J. Vis. Exp. (186), e64072, doi:10.3791/64072 (2022).
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