Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Das regulierte Gewebewachstum, bestehend aus einer Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie) und/oder Zellgröße (Hypertrophie), ist ein entscheidender Faktor für Entwicklung, Regeneration sowie ökologische und evolutionäre Anpassung. Trotz enormer Fortschritte im molekulargenetischen Verständnis sowohl der Zell- als auch der Entwicklungsbiologie in den letzten Jahrzehnten steckt das mechanistische Verständnis der Regulation von Gewebe und Organgröße noch in den Kinderschuhen. Ein Grund für diese Wissenslücke ist die Schwierigkeit, das Gewebewachstum in lebenden Organismen mit der notwendigen räumlichen und zeitlichen Genauigkeit zu quantifizieren.

Verschiedene Aspekte des Wachstums ganzer Organismen können im Laufe der Zeit wiederholt gemessen werden, wobei Wachstumskurven für jedes Individuum 1,2,3,4,5 sichtbar werden. Immer ausgefeiltere Scanmethoden wie die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA), die Computertomographie (CT) und die Magnetresonanztomographie (MRT) ermöglichen die Verfolgung des Wachstums ganzer Organe und anderer Körperregionen (z. B. einzelne identifizierte Skelettmuskeln) bei einzelnen Individuen, sowohl beim Menschen als auch in Modellorganismen 6,7,8,9,10 . Diese Methoden haben jedoch noch nicht die Auflösung, einzelne Zellen aufzudecken, und daher waren die Zusammenhänge zwischen zellulärem Verhalten und Wachstum auf Gewebeebene schwer zu erkennen. Um solche Verbindungen herzustellen, haben sich traditionelle Studien oft auf Kohorten ähnlicher Einzeltiere gestützt, von denen einige zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten geopfert und dann zytologisch detailliert analysiert werden. Solche Ansätze erfordern die Mittelung der beobachteten Veränderungen über Gruppen von (vorzugsweise ähnlichen, aber dennoch variablen) Individuen hinweg und leiden daher unter einem Mangel an zeitlicher und räumlicher Auflösung, was es schwierig macht, korrelierte Ereignisse auf zellulärer Ebene zu finden, die auf Ursache und Wirkung hindeuten.

Studien an wirbellosen Modellorganismen, zunächst in C. elegans und D. melanogaster, haben diese Probleme umgangen, indem sie optische Mikroskopie entwickelt haben, um eine zelluläre Auflösung zu erreichen und das Wachstum im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen genau zu messen. Solche Studien haben auffallend invariantes Zelllinienverhalten im Wachstum dieser kleinen Modellorganismen 11,12,13,14,15,16,17 gezeigt. Viele Tiere, einschließlich aller Wirbeltiere, haben jedoch unbestimmte Zelllinien und kontrollieren das Gewebewachstum durch mysteriöse Rückkopplungsprozesse, die dazu dienen, das genetisch kodierte Wachstumsprogramm in einen funktionsfähigen dreidimensionalen Organismus mit all seinen Geweben und Organen zu verwandeln, die in der Größe entsprechend aufeinander abgestimmt sind. Um diese komplexen Wachstumsprozesse zu verstehen, ist es wünschenswert, ganze Gewebe oder Organe im Laufe der Zeit bei einzelnen Individuen abzubilden, die durch genetische, pharmakologische oder andere Interventionen zu einem Zeitpunkt der Wahl experimentell manipuliert und die Wirkung anschließend analysiert werden können.

Jeder Skelettmuskel von Wirbeltieren hat eine definierte Größe, Form und Funktion und gut charakterisierte Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben wie Knochen, Sehnen und Nerven. Einige Muskeln sind klein, liegen knapp unter der Haut und sind daher gute Kandidaten für hochauflösende bildgebende Studien. Ähnlich wie bei den meisten Organen wächst jeder Muskel während des embryonalen, postnatalen und jugendlichen Lebens, bevor er eine stabile Erwachsenengröße erreicht. Muskeln haben jedoch auch eine einzigartige Fähigkeit, die Größe während des Erwachsenenlebens zu ändern, abhängig von Gebrauch und Ernährung¹⁸, und diese Eigenschaft hat einen großen Einfluss auf die Fitness des Organismus, die sportliche Leistung und das unabhängige Leben. Der Verlust von Muskelmasse und -funktion im Alter, Sarkopenie, ist ein Thema, das für Gesellschaften mit einer alternden Bevölkerung zunehmend Anlass zur Sorge gibt 19,20,21.

Wir und andere haben uns auf das Wachstum definierter Blöcke von Skelettmuskelgewebe im sich segmental wiederholenden Körper von Zebrafischlarven konzentriert, als ein scheinbar geschlossenes System mit mehreren hundert Zellen, in dem Gewebewachstum, -erhaltung und -reparatur beobachtet und manipuliert werden können 22,23,24,25,26. Während einige quantitative Arbeiten zuvor berichtet wurden 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35^, ist keine detaillierte und validierte Methode zur Messung des Muskelwachstums in zellulären Details in einzelnen Wirbeltierorganismen im Laufe der Zeit verfügbar. Hier wird ein effizientes Protokoll für die Durchführung solcher wiederholten Messungen beschrieben, zusammen mit der Validierung, und ein Beispiel für seine Verwendung zur Analyse von Veränderungen sowohl des hypertrophen als auch des hyperplastischen Wachstums als Reaktion auf veränderte elektrische Aktivität wird bereitgestellt.

Alle beschriebenen Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und unter geeigneten Lizenzen des britischen Innenministeriums in Übereinstimmung mit dem Animal (Scientific Procedures) Act 1986 und nachfolgenden Änderungen durchgeführt. Embryonen/Larven sollten bis zum Abschluss der Gastrulation bei 28,5 °C aufgezogen werden, können dann aber bei 22-31 °C gehalten werden, um die Entwicklungsgeschwindigkeit zu kontrollieren. Fische können bei Raumtemperatur gescannt oder stimuliert werden.

1. Zebrafischlarven anästhesieren

1. Kreuzen Sie geeignete fluoreszierende Reporterfische wie Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)^vu119Tg Referenz³⁶ oder Tg(α-Aktin:mCherry-CAAX)^pc22Tg Referenz 37 und sammeln Sie Embryonen wie beschrieben³⁸.
2. Zum Zeitpunkt der Wahl, z. B. 2 Tage nach der Befruchtung (dpf), betäuben Sie die Embryonen kurz mit Tricain-haltigem Fischmedium (entweder Fischwasser oder E3-Medium) und suchen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop wie einem Leica MZ16F nach EGFP oder mCherry. Wenn man viele Embryonen hat, wählen Sie diejenigen mit dem hellsten Signal aus. Bringen Sie die Embryonen unmittelbar nach dem Screening in ein normales Fischmedium zurück.

2. Montage von Fischen für konfokales Scannen

1. Schalten Sie das konfokale Laserscanning-System und die Laser ein, damit sich das System für 30-60 Minuten stabilisieren kann.
   HINWEIS: Hier haben wir ein Zeiss LSM 5 Exciter-Mikroskop mit aufrechtem Materialständer (der den Arbeitsabstand erhöht) verwendet, das mit einem 20x/1,0 W Wassertauchobjektiv ausgestattet ist.
2. Bereiten Sie 1% niedrigschmelzende Agarose (LMA) vor und bewahren Sie sie in einem 37 °C heißen Hitzeblock zur wiederholten Anwendung in einem 1,5-ml-Röhrchen auf. Um einen Hitzeschock zu vermeiden, entfernen Sie das LMA-Aliquot aus dem Wärmeblock und lassen Sie es bis knapp über die Einstellung abkühlen, bevor Sie es auf die Larve auftragen, und testen Sie gegen die Haut, um die geeignete Temperatur zu beurteilen, wie bei der Beurteilung der Temperatur von Babynahrungsmilch.
3. Wählen Sie Fische aus, die montiert werden sollen, und betäuben Sie jeden Fisch nacheinander vorübergehend mit Tricain (0,6 mM in Fischmedium).
4. Nehmen Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm, die mit einer Schicht von 1% Agarose beschichtet wurde, und legen Sie sie auf die Bühne eines Seziermikroskops.
5. Die Larve mit einer 1 ml Kunststoff-Pasteur-Pipette auf die 60 mm beschichtete Petrischale geben und so viel übertragenes Medium wie möglich entfernen. Geben Sie dann immer noch mit der Pasteur-Pipette 5 bis 10 Tropfen LMA auf den Fisch und positionieren Sie sich schnell horizontal in Seitenansicht mit einer Pinzette (oder einer feuerpolierten feinen Glasnadel), bevor die LMA aushärtet. Für eine optimale Bildgebung ist es wünschenswert, die Larve nahe der Oberseite der LMA zu positionieren.
   1. Alternativ können Sie mit einer 1-ml-Pasteur-Pipette aus Kunststoff die Larve mit so wenig Fischmedium wie möglich sammeln und die Larve in das Aliquot des gekühlten LMA überführen. Lassen Sie die Larve für 5 s sinken, um vollständig von LMA umgeben zu werden. Dann holen Sie die Larve und geben Sie sie in einem Tropfen LMA auf die mit Agarose überzogene Petrischale. Orientieren und positionieren Sie die Larve schnell wie oben beschrieben.
6. Die Larve ist sowohl mit ihrer anteroposterioren als auch mit ihrer dorsoventralen Achse innerhalb von 10° von der Horizontalen auszurichten (siehe Anmerkung "Über Fehler und ihre Korrektur" unter Nummer 4.6).
   1. Wenn die Larve nicht korrekt horizontal in der Nähe der Oberfläche des Agarosentropfens montiert ist, entfernen und wieder einbetten. Larven können leicht durch sanftes Absaugen mit einer mikrofeinen 1-ml-Kunststoff-Pasteur-Pipette entnommen werden, und LMA kann vorsichtig mit Kimwipes entfernt werden. Übung macht wirklich den Meister im Montagevorgang; Verbringen Sie einen Nachmittag damit, einige unwichtige Larven einzubetten, bevor Sie dies an einem echten Experiment versuchen.
      HINWEIS: Zum Mikroskopdesign: Viele Labore verwenden invertierte konfokale Mikroskope für die Bildgebung durch ein Deckglas. Wir haben festgestellt, dass das wiederholte Einbetten und Entfernen von Fischen, die in Agarose gehalten werden, unter einem Deckglas zur Beobachtung in einem inversen Mikroskop zu einem größeren Probenverlust bei wiederholtem Scannen führt als bei dem beschriebenen Verfahren mit einem aufrechten Mikroskop. Aus diesem Grund empfiehlt sich die Verwendung eines aufrechten Systems, sofern vorhanden. Ein Schlüssel zu qualitativ hochwertigen Daten ist jedoch die richtige Auswahl und Verwendung von Ziel- und Scanparametern, ein Thema, das zu groß ist, um hier diskutiert zu werden.

3. Konfokales Scannen

1. Wenn LMA ausgehärtet ist, spülen Sie die Schale mit etwa 10 ml Tricain-haltigem Fischmedium. Wenn Sie konfokale Stapel erfassen möchten, lassen Sie die montierten Fische mindestens 10 Minuten ruhen, bevor Sie mit dem Scannen fortfahren, da eine gewisse Agarose-Schwellung auftritt.
2. Laden Sie die Probenschale auf die Stufe des konfokalen Systems, lokalisieren Sie die Larve und konzentrieren Sie sich auf das gewünschte Somit. Somite 17 kann aufgrund seiner einfachen Lokalisation in der Nähe des Analschlotes und der einfachen Bildgebung gewählt werden. Überprüfen Sie, indem Sie Somiten von vorne zählen.
   HINWEIS: Der erste Somit ist hinter dem Ohr verschmolzen und hat keinen vorderen Rand, kann aber leicht beobachtet werden, dass er quergestreifte Muskelfasern hat.
3. Richten Sie sich so ein, als ob Sie einen Z-Stapel erfassen würden, indem Sie oben (dh direkt über der Haut) und unten (dh direkt unter dem Notochord) definieren, um den gesamten Somiten einzubeziehen, auch wenn der Fisch leicht schief montiert ist). Sowohl die linke als auch die rechte Seite können beliebig erfasst werden. Dadurch wird sichergestellt, dass alle schnellen YZ-Scans die gewünschten Regionen erfassen.
4. Nehmen Sie wie folgt ein XY-Bild auf. Richten Sie den Scanbereich in Bezug auf die Fische aus, wie es die konfokale Software zulässt. Positionieren Sie den Fisch mit der anteroposterioren Achse parallel zur abgebildeten X-Achse und der dorsoventralen Achse parallel zur Y-Achse mit Somit 17 in der Mitte des Feldes, wie in Zusatzdatei 1 gezeigt. Konzentrieren Sie sich auf eine mittlere Ebene im obersten Myotom, in der die gesamten epaxialen und hypaxialen Somithälften zusammen mit den vertikalen und horizontalen Myosepten sichtbar sind und ein hochauflösendes XY-Bild aufnehmen. Denken Sie daran, das Bild zu benennen und zu speichern.
5. Nehmen Sie ein oder mehrere YZ-Bilder wie folgt auf. In den repräsentativen Ergebnissen (unten) wird die Genauigkeit von 2-Slice- und 4-Slice-Methoden verglichen. Beim 2-Slice-Ansatz werden einzelne XY - und YZ-Scans verwendet. Beim 4-Schichten-Ansatz werden drei YZ-Scans gemittelt, um eine genauere Schätzung des Myotomvolumens zu erhalten. Wenn von der konfokalen Software gefordert, richten Sie das Scanfeld neu aus.
   1. Zeichnen Sie eine präzise dorsale bis ventrale Linie über den gewählten Somiten senkrecht zur anteroposterioren Achse des Fisches in einer ausgewählten anteroposterioren Position. Führen Sie einen Z-Stack-Zeilenscan durch.
   2. Wiederholen Sie den YZ-Linienscan dreimal an definierten anteroposterioren Positionen entlang des ausgewählten Myotoms, um YZa, YZm und YZp zu erfassen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt. Benennen und speichern Sie diese Bilder zusammen mit dem zugehörigen XY-Bild.
      HINWEIS: Bei Auswahl der YZ-Ebenen: Das Myotom ist V-förmig und seine Form ändert sich während des Wachstums. Um die genaueste Beurteilung des Myotom-17-Volumens mit der 4-Schicht-Methode zu erhalten, positionieren Sie YZa auf der vorderen Spitze des Myotoms, YZp auf den hinteren Spitzen des Myotoms an dorsalen und ventralen Extremen und YZm auf halbem Weg zwischen YZa und YZp. Unter der Annahme, dass sich der Somit gleichmäßig verjüngt, repräsentiert der Mittelwert der Messungen aus jedem YZ-Abschnitt das Myotom als Ganzes. Bei der 2-Schicht-Methode sollte der einzelne YZ-Scan am hinteren Ende des horizontalen Myoseptums positioniert werden, was in etwa dem anteroposterioren Zentrum des interessierenden Myotoms (z. B. YZm) entspricht. Alternativ kann ein Satz von drei YZ-Abschnitten am vorderen, mittleren und hinteren Teil des horizontalen Myoseptums durchgeführt werden, aber, wie unten gezeigt, wird eine solche Messung das Myotomvolumen leicht über- oder unterschätzen (für rostrale bzw. kaudale Somiten aufgrund der Verjüngung des Myotoms). Grundsätzlich ist die Konsistenz in der Positionierung von YZ-Schichtebenen zwischen Fischen und Experimenten der Schlüssel zur Reproduzierbarkeit.

4. Würdigung

1. Da das Myotom die Größe entlang des Fisches in einer abgestuften Weise ändert, arbeiten Sie in vergleichenden Studien immer mit dem gleichen Somit.
2. Um das Myotomvolumen zu messen und zu berechnen, verwenden Sie die konfokale Software (z. B. die .lsm-Dateien, die mit der Zeiss ZEN-Mikroskopsoftware erstellt wurden) oder die Open-Source-Software für die universelle Bildanalyse wie Fiji/ImageJ.
   HINWEIS: Wenn Sie Dateiformate ändern, stellen Sie sicher, dass die Z-Schritt-Größe korrekt übertragen wird, da nicht jede Software proprietäre konfokale Dateiformate korrekt lesen kann. Um beispielsweise ein ZEN-Zeilenscanbild in Fidschi zu importieren, verwenden Sie zuerst den Befehl Datei/Exportieren, um als .tif im Fenster Bild mit voller Auflösung - Einzelebenenformat zu exportieren, und importieren Sie es dann in Fidschi. Obwohl YZ scan.lsm direkt in Fidschi geöffnet werden kann, werden die resultierenden YZ-Bilder aufgrund falscher Auswertung der Z-Schrittweite in der Regel in der Z-Dimension komprimiert.
3. Analyse mit ZEN
   1. Öffnen Sie zunächst die XY-Dateien scan.lsm in ZEN. Wechseln Sie zur Registerkarte Grafiken und wählen Sie das Linienwerkzeug aus. Zeichne eine Linie zwischen den beiden vertikalen Myosepten von Somit 17, die sich über die gesamte Myotomlänge erstrecken (parallel zur anteroposterioren Achse des Fisches). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen M, um die Werte der Messung anzuzeigen (Länge = 89,71 μm, siehe Zusatzdatei 2).
   2. Öffnen Sie die YZ scan.lsm-Dateien. Wählen Sie auf der Registerkarte Grafiken das Werkzeug Geschlossener Bézier aus. Zeichne um den Umfang des Myotoms. Wenn Sie fertig sind, aktivieren Sie das Kästchen M, dies würde den Wert der Messung anzeigen (Fläche = 11980,01 μm², siehe Zusatzdatei 3).
   3. Notieren Sie die Werte jeder Messung manuell in einer Tabelle. Mittelwert der CSA-Messungen nach Bedarf. Das Volumen des Myotoms kann als Volumen = Myotomlänge x CSA berechnet werden, d. h. 89,71 μm x 11980,01 μm² = 1,075 x 10⁶ μm³.
4. Analyse mit Fiji/ImageJ
   1. Öffnen Sie die XY-Dateien scan.lsm in Fiji/ImageJ. Überprüfen Sie, ob XY-Bilder , die direkt in Fidschi geöffnet werden, korrekt skaliert sind, wie sie sein sollten.
   2. Wählen Sie das Werkzeug "Gerade Linie" aus den Symbolen aus. Zeichnen Sie eine Linie entlang der Länge von Somit 17, wie in Schritt 4.3.1 beschrieben. Legen Sie die Messparameter fest, indem Sie zu Analysieren gehen, dann Messungen einstellen... auswählen und die folgenden Kontrollkästchen Bereichs- und Anzeigebeschriftung aktivieren. Um zu messen, drücken Sie einfach die Tastenkombination M oder gehen Sie zum Menü Analysieren und wählen Sie Messen. Ein Popup-Fenster listet alle Messwerte auf (d.h. Länge = 90,023 μm; siehe Zusatzdatei 4). Die Ergebnisse können in Form von .csv gespeichert und in Microsoft Excel o.ä. zur späteren Analyse geöffnet werden.
   3. Um CSA auf den YZ-Bildern zu messen, öffnen Sie YZ-Bilder in .tif Format, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
   4. Kalibrieren Sie die YZ -.tif-Bilder, da sie beim Export unkalibriert sind. Parameter für die Kalibrierung können in ZEN abgerufen werden, indem Sie auf die Info der ausgewählten Bilder gehen: Notieren Sie die Werte Scaling X (0,489 μm) und Scaling Z (0,890 μm; siehe Zusatzdatei 5). Als nächstes, während die Bilder in Fidschi geöffnet sind, gehen Sie zu Bild und wählen Sie Eigenschaften.... Geben Sie 0,489 μm für die Pixelbreite und Pixelhöhe und 0,890 μm für die Voxeltiefe ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global , um die Kalibrierung universell anzuwenden, wenn eine wiederholte Messung von YZ-Bildern erwartet wird (siehe Zusatzdatei 6).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle YZ-Bilder mit den gleichen Scanparametern aufgenommen werden. Starten Sie Fiji/ImageJ neu oder ändern Sie die Kalibrierungswerte, wenn ein neuer Kalibrierungssatz erforderlich ist.
   5. Um die CSA der kalibrierten YZ-Bilder zu messen, wählen Sie das Werkzeug Polygonauswahl aus den Symbolen aus. Zeichnen Sie um den Umfang des Somiten herum und drücken Sie M , um die Werte der Messung anzuzeigen (Fläche = 11980,395 μm²; siehe Zusatzdatei 7). Das Volumen des Myotoms kann als Volumen = Myotomlänge x CSA berechnet werden, d. h. 90,023 μm x 11980,395 μm² = 1,079 x 10⁶ μm³.
   6. Wiederholen Sie die Messungen auf den anderen XY- und YZ-Bildern. Es wird empfohlen, die gleiche Software für alle Messungen innerhalb einer Versuchsreihe zu verwenden, um die Konsistenz zu gewährleisten. Die Volumenschätzung jeder Software ist ähnlich, aber aufgrund der unterschiedlichen Zeichenwerkzeuge nicht identisch, d. H. ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 und Fidschi / ImageJ = 1,079 × 10⁶ μm³. Das Wachstum des Myotoms zwischen zwei Zeitpunkten (d.h. 3 bis 4 dpf) kann wie folgt berechnet werden: (Volume 4 dpf - Volume 3 _dpf)/ Volume _{3 dpf} × 100%.
      HINWEIS: Bei Fehler und dessen Korrektur. Während der Montage sollte der Fisch mit seiner sagittalen Ebene (d.h. der anteroposterioren und dorsoventralen Achse) so nah wie möglich an der Horizontalen ausgerichtet werden, um ein Gieren bzw. Rollen zu vermeiden. Dies liegt daran, dass sowohl die aus dem XY-Scan gemessene Myotomlänge L als auch die aus einem YZ-Scan gemessene CSA überschätzt werden, wenn der Fisch aufgrund einer schrägen anteroposterioren Montage eine Gage (Rotation um die dorsoventrale Achse) zeigt. Weder Nicken noch Rollen während der Montage sollten die Messungen nach dem Scannen beeinflussen, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Dennoch verschlechtert die dorsoventrale Rotation (Roll) die Bildqualität. Die einfache Trigonometrie zeigt, dass bis zu 10° Gierfehler bei der Volumenmessung 3% ergeben, wobei L und CSA jeweils proportional zu (cosq)^-1 zunehmen, wobei q der Winkel von anteroposterior horizontal (Gieren) ist. 15° und 20° Off ergeben 7% bzw. 13% Überschätzungen des Volumens.
      Da das Notochord zylindrisch ist, kann die Einbeziehung des gesamten Notochord in den YZ-Scan verwendet werden, um den Winkel und das Ausmaß der Neigung aus der Orientierung und Größe der Haupt- und Nebenachse zu berechnen und dadurch die gemessene L und CSA zu korrigieren, um die Genauigkeit zu maximieren. Korrigierte CSA = Gemessene CSA x Notochord-Nebenachse/Notochord-Hauptachse. Korrigiert L = Gemessen L x Notochord-Nebenachse/Notochord-Achse in Mikroskop-Z-Richtung .
      Eine weitere Überlegung erlaubt eine zusätzliche Korrektur von L. Wenn das Myotom wächst, neigt es sich in der koronalen Ebene (normal zur dorsoventralen Achse), so dass das mediale Myotom leicht vor dem lateralen Myotom liegt. Von dorsal betrachtet bilden die vertikalen Myosepten auf der linken und rechten Seite einen breiten Chevron, der nach vorne zeigt. Wenn die Gähne niedrig ist, hat diese Morphologie keinen Einfluss auf die Messung von L. Wenn die Gähne jedoch signifikant ist, wird die trigonometrische Korrektur zu einer Herausforderung, und ein besserer Ansatz besteht darin, True L direkt zu messen, indem die XYZ-Koordinaten der beiden Punkte geschätzt werden, an denen die vorderen und hinteren vertikalen Myosepten auf den Notochord am horizontalen Myoseptum treffen. Die einfache Trigonometrie erlaubt die Berechnung von True L aus diesen Koordinaten als L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)²]. Die Schwächen dieses letzten Ansatzes bestehen darin, dass a) die Auswahl der Punkte je nach Bediener variieren kann und b) keine visuelle Aufzeichnung der ausgewählten Punkte beibehalten wird. Diese Überlegung hat keinen Einfluss auf die CSA-Korrektur.

5. Optionale Methode: Muskelelektrische Aktivität entfernen und wieder einführen

1. Erstellen Sie eine Stimulationskammer.
   1. Nehmen Sie eine 6 x 35 mm große Vertiefungsplatte, und erzeugen Sie zwei kleine Öffnungen (<5 mm Durchmesser, 1 cm Abstand) auf jeder Seite jeder Vertiefung (siehe Abbildung 1) mit einem schmalen Lötkolben.
      HINWEIS: Behandeln Sie den heißen Lötkolben vorsichtig und arbeiten Sie bei Bedarf in einem Abzug, um das Einatmen von Dampf zu vermeiden.
   2. Fädeln Sie ein Paar Silber- oder Platindrähte (~20 cm lang) durch die Öffnungen jedes Vertiefungs (siehe Abbildung 1). Wiederverwendbares Klebematerial (z. B. BluTack) kann in der Nähe der Öffnungen aufgetragen werden, um die Drähte an Ort und Stelle zu halten und einen Abstand von 1 cm zwischen den Drähten zu gewährleisten (siehe Abbildung 1).
2. Bei 3 dpf den Fisch in drei Bedingungen aufteilen: Fisch medium Control, Inactive und Inactive + Stim.
   1. Für inaktive und inaktive+Stim-Gruppen die Larven 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit Tricain (0,6 mM) anästhesieren.
      ANMERKUNG: Gemäß Referenz³⁸ werden gefrorene Aliquots des Tricainbestands aufgetaut und verdünnt (40 μL/ml Fischmedium auf eine Endkonzentration von 0,6 mM), bevor sie dem Fisch hinzugefügt werden. Fügen Sie Tricain nicht direkt in das fischhaltige Wasser hinzu, da einige Fische hohe Dosen erhalten könnten. Tricainbrühen sollten innerhalb eines Monats verbraucht und niemals wieder eingefroren werden.
   2. Für den Fisch Medium Kontrollfische, lassen Sie sie unbetäubt.
3. Zu ausgewählten Zeitpunkten nach Beginn der Tricain-Exposition (d. h. bei 80 hpf) bereiten Sie die Inactive+Stim-Gruppe auf die Stimulation vor.
   1. Bereiten Sie 60 ml 2% Agarose (1,2 g Agarosepulver in 60 ml Fischmedium) vor und schmelzen Sie vollständig in der Mikrowelle, kühlen Sie ab, fügen Sie Tricain hinzu und gießen Sie 4 ml in jede Vertiefung der Stimulationskammer (Abbildung 1).
   2. Fügen Sie sofort maßgeschneiderte 4-Well-Kämme zwischen die Elektroden (erstellt durch Ausschneiden von Kunststoffen (z. B. Polypropylen) mit den gewünschten Abmessungen und Zusammenkleben mit Sekundenkleber; siehe Abbildung 1). Lassen Sie 10 Minuten für das Gel aushärten. Entfernen Sie die Kämme vorsichtig, um vier rechteckige Vertiefungen zu schaffen.
   3. Füllen Sie jede Vertiefung mit Tricainwasser und legen Sie eine einzelne betäubte Inactive+Stim-Larve mit einer Mikropipette in jede Vertiefung, wobei ihre anteroposteriore Achse senkrecht zu den Elektroden steht (siehe Abbildung 1).
   4. Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, ob jeder Fisch in jedem Vertiefung der Kammer vollständig betäubt ist.
4. Verbinden Sie einen einstellbaren elektrophysiologischen mustererzeugenden Stimulator über einen Polaritätsregler mit der Kammer, indem Sie Krokodilclips verwenden, die mit jeder der Elektroden auf einer Seite der Kammer verbunden sind (siehe Abbildung 1).
   HINWEIS: Der Polaritätsregler wird verwendet, um die Polarität alle 5 s umzukehren, um Elektrolyse und Korrosion der Elektroden zu verhindern.
5. Fische stimulieren. Zum Beispiel ergibt 1s mit einem Zug von 200, 20 V-Impulsen, mit 0,5 ms Pulsdauer und 4,5 ms Pulstrennung, einmal alle 5 s ein effektives wiederholt-tetanisches Kontraktionswiderstandsregime.
6. Überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, ob die Fische stimuliert werden. Das Beispiel für einen elektrischen Reiz sollte einmal alle 5 s eine sichtbare bilaterale Kontraktion und leichte Bewegung induzieren.
7. Für ein Widerstands- / Hochkraftregime stimulieren Sie den Fisch mit einer hohen Frequenz für einen Kampf von 5 Minuten, dreimal, wobei jeder Kampf durch 5 Minuten Ruhe getrennt ist.
   HINWEIS: Während Fische auf einer Seite der Kammer ruhen, können die Krokodilclips mit dem Elektrodenpaar auf der anderen Seite der Kammer verbunden und diese zusätzlichen Fische stimuliert werden.
8. Entfernen Sie nach der Stimulation vorsichtig Fische aus jedem Brunnen, indem Sie sie vorsichtig mit einer Plastikpipette ausspülen, und kehren Sie in frischem Tricain-haltigem Fischmedium in den Inkubator zurück.
9. Gießen Sie das Tritainwasser aus der Kammer weg und verwenden Sie eine Pinzette, um die Agarose aus jedem Brunnen zu schneiden und zu entfernen. Die Brunnen mit Leitungswasser abspülen und trocknen lassen.
   HINWEIS: Bei Verwendung von Silberdrahtelektroden kann sich nach einem Stimulationsexperiment gelegentlich Silberoxid auf der Oberfläche des Drahtes ansammeln. Da Silberoxid weniger leitfähig ist als Silber, um die Reproduzierbarkeit zu erhalten, reiben Sie Silberoxid vorsichtig mit Kimwipes vom Draht ab, bevor Sie das Setup wiederverwenden.

Eine schnelle und präzise Messung des Somit-Volumens
Es wird eine Methode der Probenvorbereitung, Datenerfassung und volumetrischen Analyse beschrieben, die die schnelle Messung des Muskelwachstums in Zebrafischlarven ermöglicht. Die Muskelgröße kann bei lebenden Tieren gemessen werden, indem Fische verwendet werden, die auf ihren Plasmamembranen mit einem membrangezielten GFP (β-Aktin:HRAS-EGFP ) oder mCherry (α-Aktin:mCherry-CAAX ) markiert sind. Die Larven wurden vorübergehend mit Tricain betäubt, in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt montiert und mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Somite 17 wurde für die Analyse der Muskelgröße ausgewählt, da es an der Rumpf-Schwanz-Schnittstelle³¹ zugänglich ist. In der Praxis kann das Myotomvolumen wie in der Theorie als Produkt aus Myotomlänge (L) und Mittelwert von drei Querschnittsflächenmaßen (CSA) berechnet werden (Abbildung 2A, die als 4-Schicht-Methode bezeichnet wird).

Um diese Methode zu validieren, wurden ganze myotome konfokale Z-Stapel lebender Zebrafischlarven (Abbildung 2B) erhalten, und das Somitvolumen wurde berechnet, indem die Summe der Somit 17 Profilbereiche in jeder Scheibe (80-100 Scheiben) mit dem Abstand zwischen den Scheiben (1-1,2 μm) multipliziert wurde. Es wurde eine starke Korrelation zwischen den 4-Slice- und Full-Stack-Berechnungsmethoden beobachtet (Abbildung 2C). Die 4-Schicht-Methode ergab jedoch im Allgemeinen eine etwas größere Volumenschätzung (~ 2% größer im Durchschnitt) (Abbildung 2D). Dieser Unterschied könnte entweder auf a) die Schräglage der Proben zurückzuführen sein, die eine fälschlicherweise große Volumenmessung ergaben, oder b) auf die Beobachtung, dass sich Zebrafischmyotome entlang der anteroposterioren Achse verjüngen und zum Schwanz des Tieres hin kleiner sind. Da die YZa-, YZm- und YZp-CSA-Messungen in Richtung des vorderen Teils des Somit-17-Myotom-Chevrons liegen (Abbildung 2A), wurde die letztere Interpretation durch volumetrische Analyse der Myotome der Somiten 16 und 18 getestet. Jeder Somit war etwa 7% größer als der dahinter liegende (Abbildung 2E). Weitere Analysen ergaben, dass eine 2-Schicht-Methode, die nur eine einzige YZ-Messung erfordert, die sich in der Mitte des Somit befindet, wo sich die epaxialen und hypaxialen Hälften am horizontalen Myoseptum (YZm) treffen, und die XY-Scheibe eine ziemlich genaue Schätzung des Myotomvolumens liefert (Abbildung 2F, G). Der 2-Scheiben-Ansatz ermöglicht eine schnellere Datenerfassung, wenn Zeitbeschränkungen die Anzahl der Fische, die gescannt werden können, begrenzen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass das Myotomvolumen in lebenden Zebrafischlarven schnell und genau gemessen werden kann. Einzelne Larven wurden mit dieser Methode wiederholt erfolgreich über einen Zeitraum von 6 Tagen gemessen.

Für die vergleichende Untersuchung des Wachstums einer identifizierten Gewebeeinheit liefert die beschriebene Methode zuverlässige und präzise Volumenschätzungen. Um genaue absolute Volumina zu erhalten, können jedoch eine Reihe von Modifikationen vorgenommen werden. Erstens kann eine Korrektur für Fehler vorgenommen werden, die durch schräge Montage verursacht werden, entweder durch Kippen der Schale oder des Mikroskoptisches, um bessere transversale YZ- und parasagittale XY-Schnitte während der Bildgebung zu erhalten, oder durch Verwendung des Notochordprofils in YZ-Schnitten; Die kleine Querschnittsachse zeigt den wahren Durchmesser des zylindrischen Notochords, während seine Hauptachse den Winkel und die Größe der Schräglage anzeigt (siehe Anmerkung unter Nummer 4.6). Zweitens muss die Position der XY- und YZ-Schnitte während des Scannens so gewählt werden, dass sie die gewünschten Myotome genau widerspiegelt. (Siehe Anmerkung unter Punkt 4.6). Beachten Sie jedoch, dass sich die Form der Myotom-Chevrons je nach Entwicklungsstadium ändert und dies bei der Auswahl von YZ-Scans berücksichtigt werden muss. Um schließlich festzustellen, ob Veränderungen des Myotoms 17 das Muskelwachstum in der gesamten Achse widerspiegeln, können Myotome weiter in die Rumpf- oder Schwanzregionen nach der beschriebenen Methode gemessen werden.

Wiederholte Messungen zeigen Somitenwachstum
Ein Vorteil der beschriebenen Methode ist die einfache wiederholte Analyse an einzelnen Fischen. Einzelne Embryonen und Larven können wiederholt eingebettet, gemessen und freigesetzt werden, ohne offensichtliche Langzeiteffekte zu erleiden (Abbildung 2H). Das Myotom wächst nachweisbar sowohl in L als auch in CSA zwischen 2 und 5 dpf, was zu einer stetigen Zunahme des Volumens führt (Abbildung 2H). Das Wachstum wurde auf diese Weise zwischen 1 und 8 dpf abgebildet und Larven wurden auch nach der Bildgebung freigesetzt und wuchsen bis ins Erwachsenenalter. Es wird erwartet, dass Analysen bis in die späte Larvenperiode hinein möglich sind, obwohl die Auswirkungen einer wiederholten Bildgebung auf das Fressverhalten im Vergleich mit Geschwistern, die nicht abgebildet sind, sorgfältig überwacht werden müssten. Wichtig ist, dass die Entwicklung der Pigmentierung die Bildgebung verdecken kann. Während die Pigmentierung bei richtig ausgerichteten Fischen kein Problem darstellt, da die Melanophorstreifen die erforderlichen Messungen nicht verhindern, kann das Pigment in schräg gelagerten Proben problematischer sein. Die Verwendung von pigmentierten Mutantenlinien, wie roy;mitfa³⁹, wird erwartet, was das Zeitfenster der Wachstumsmessungen verlängern würde, bis die Grenzen der praktikablen konfokalen Scantiefe erreicht sind.

Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens ist die einfache detaillierte Analyse des Wachstums einzelner Fasern im Vergleich zu ihrem gesamten Myotom über kurze Zeiträume. Durch Mosaikmarkierung von Fasern durch DNA-Injektion wurde eine Methode entwickelt, um die Kernaufnahme und das Wachstum in einzelnen identifizierten Fasern über 4 h zu erkennen und dann zu einem späteren Zeitpunkt erneut zu analysieren (Abbildung 2I). Darüber hinaus kann das Wachstum des gesamten Myotoms über 12 h oder weniger²⁶ gemessen werden (und Daten werden nicht gezeigt). Durch wiederholte Messungen desselben Fisches wird die interindividuelle Variabilität eliminiert und eine kleine Anzahl von Tieren kann statistisch robuste Ergebnisse liefern²⁶.

Manipulationen, die das Somitenvolumen verändern, können leicht erkannt werden
Das aktuelle Protokoll ermöglicht es, Veränderungen im Muskelwachstum unter verschiedenen biologischen und physiologischen Bedingungen, wie z.B. veränderter körperlicher Inaktivität, zu hinterfragen. Das Anästhetikum Tricain, das Nervenaktionspotentiale blockiert, indem es spannungsabhängige Na⁺ -Kanäle⁴⁰ hemmt, wurde verwendet, um Muskelinaktivität in β-Aktin:HRAS-EGFP-Larven zu induzieren. Wie bereits^{gezeigt 26}, reduzierte die Inaktivität für 24 h zwischen dem dritten und vierten dpf das Myotomvolumen stark, was darauf hindeutet, dass das Muskelwachstum der Larven aktivitätsabhängig ist (Abbildung 3A). Der Effekt der Inaktivität kann auch mit anderen Nachweismethoden untersucht werden, die die Struktur des Somits aufdecken, wie mCherry-CAAX (entweder in einer transgenen Linie oder durch mRNA-Injektion) oder durch nächtliches Eintauchen von Larven in BODIPY-Farbstoff (Abbildung 3A). Der letztgenannte Ansatz beseitigt zwar die Notwendigkeit, Fische auf transgene Hintergründe zu kreuzen oder Embryonen zu injizieren, kann aufgrund der Toxizität von BODIPY nicht für wiederholte Messungen verwendet werden. Somit erlaubt die aktuelle Methode, Veränderungen im Volumen des Muskelgewebes reproduzierbar zu messen.

Wie oben beschrieben, können genetische Markierungsmethoden verwendet werden, um wiederholte Messungen des Myotomvolumens durchzuführen, die es ermöglichen, die Veränderung der Muskelgröße über aufeinanderfolgende Tage bei einzelnen Fischen zu verfolgen. Da sich einzelne Fische und ganze Fische im gleichen Entwicklungsstadium im absoluten Myotomvolumen unterscheiden (Abbildung 3A; möglicherweise aufgrund der Größe oder Gesundheit der Eier), reduziert die Fähigkeit, das Wachstum jedes Individuums zu messen, die Auswirkungen individueller Variationen, indem sie gepaarte statistische Analysen der Stichprobe ermöglicht. Die wiederholte Messung desselben Fisches reduziert die Anzahl der Fische, die benötigt werden, um Effekte robust zu erkennen. Um diesen Effekt zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse aus der Analyse des Wachstums jedes Individuums von 3 bis 4 dpf in Populationen aktiver und inaktiver Larven mit der Analyse derselben beiden Populationen verglichen, wobei nur das einzige Maß der Myotomgröße bei 4 dpf verwendet wurde. Von Lay zu Lay wurde eine größere Variation in der scheinbaren Reduktion der Myotomgröße beobachtet, wenn das Myotomvolumen nur bei 4 dpf gemessen wurde, verglichen mit der Messung von 4/3 dpf Volumen für jedes Individuum (Abbildung 3B). Beachten Sie den größeren Reduktionsbereich (68% -91%) in den 4 dpf only-Messungen im Vergleich zur 4/3 dpf-Methode (78%-89%) und die schwache Korrelation zwischen den beiden Messungen. Obwohl wie erwartet die mittlere Reduktion über alle 13 biologischen Replikate in jeder Bewertung ähnlich war (Abbildung 3C) und 82,62 ± 1,01% (Mittelwert ± SEM, n = 13) für die 4/3 dpf-Methode und 82,31 ± 1,92% für die 4-dpf-only-Methode betrug, war der geschätzte Fehler bei der 4-dpf-only-Methode fast doppelt so hoch wie bei der 4/3-dpf-Methode. Daher ist die Quantifizierung des individuellen Wachstums durch wiederholte Messung die genauere Methode, indem die Größenvariabilität zwischen Fischen innerhalb derselben Lage eliminiert wird, wie zuvor gezeigt²⁶. Da jedoch kein signifikanter Unterschied in der durch Inaktivität verursachten Verringerung des Myotomvolumens beobachtet wurde, wenn das Myotomvolumen nur bei 4 dpf gemessen wurde (Abbildung 3C), deuten die Daten darauf hin, dass ~ 6-8 Fische ausreichen, um den interindividuellen Größenunterschied innerhalb eines Lays zu mitteln. Wenn die Größenänderungen klein sind, wird eindeutig die 4/3-dpf-Methode bevorzugt.

Analyse der zellulären Wachstumsgrundlagen
Myotom CSA wird durch Muskelfaseranzahl und Fasergröße bestimmt. Die Faserzahl kann geschätzt werden, indem die Anzahl der schnellen und langsamen Fasern auf drei YZ-Abschnitten (YZ a, YZ m, YZ p) gezählt wird. Obwohl Regionen von zwei benachbarten Myotomen in solchen YZ-Abschnitten enthalten sind, wie das Vorhandensein von vertikalen Myosepten (VM) in den meisten Abschnitten zeigt (Abbildung 2A), spiegeln diese Zahlen die Faserzahl genau wider. Eine Überzählung tritt bei VMs aufgrund der Verjüngung von Faserpaaren aus jedem benachbarten Segment an der VM auf (Abbildung 4A). Eine solche Überzählung kann mit der folgenden Gleichung erklärt werden: Faserzahl = Gesamtzahl der Fasern - (Fasern in Kontakt mit VM) / 2 Referenz³³. Darüber hinaus kann das durchschnittliche Faservolumen bestimmt werden, indem das Myotomvolumen durch die Anzahl der Fasern dividiert wird. Wir haben diese Analysen verwendet, um zu zeigen, dass die Aktivität beide zellulären Aspekte des Wachstums steuert (Abbildung 4B, C).

Aus Abbildung 2A geht hervor, dass die Fasern im Myotom unterschiedlich groß sind, eine Realität, die sich nicht in berechneten durchschnittlichen Faservolumenmessungen widerspiegelt. Durch Ziehen um jede Faser von Somit 17 von zwei Fischen wurde gezeigt, dass die gemessene Faserquerschnittsfläche von 28 μm 2 bis 217 μm² reicht (Abbildung 4D). In Wirklichkeit sind jedoch viele Fasern innerhalb des Myotoms schräg abgewinkelt, so dass solche CSA-Maße nicht den wahren CSA einer Faser senkrecht zu ihrer Längsachse widerspiegeln. Umgekehrt haben aufgrund der unterschiedlichen Winkel der Fasern innerhalb des Myotoms alle Fasern, die in Orientierungen verlaufen, die nicht anteroposterior ausgerichtet sind, Längen, die sich von der Myotomlänge unterscheiden. Trotz dieser Vorbehalte, die nur entweder durch vollständige Segmentierung des Myotoms in einzelne Faservolumina oder durch Berechnung nach Messung des Schrägwinkels jeder Faser umgangen werden können, liefern die gemessenen CSAs eine Schätzung der Fasergrößendiversität in jedem Fisch. Zum Beispiel nahmen einzelne Fasern in CSA mit Inaktivität ab, was zu einer Verschiebung nach links in der kumulativen Frequenzkurve in Bezug auf aktive (nicht anästhesierte) Kontrolllarven führte (Abbildung 4E). Da inaktive Fische ~10 Ballaststoffe weniger haben als aktive Fische (Abbildung 4B), wurden entweder die 10 kleinsten Fasern von aktiven, nicht betäubten Fischen (unter der Annahme, dass sie die neuen sind) oder die 10 größten (als alternatives Extrem) aus dem Vergleich weggelassen, was zeigte, dass der größte Verlust des Myotomvolumens auf mangelndes Faserwachstum zurückzuführen ist. und nicht das Versagen der neuen Faserbildung (Abbildung 4F). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die beschriebene Methode eine detaillierte Untersuchung der Rolle von körperlicher Aktivität bei der Bildung und dem Wachstum von Muskelgewebe ermöglicht.

Wiedereinführung der Aktivität durch elektrische Stimulation
Körperliche Aktivität ist für das Muskelwachstum erforderlich (Abbildung 3A). Es wird ein Verfahren beschrieben, um Muskelkontraktionen durch elektrische Stimulation bei ansonsten inaktiven Larven wieder einzuführen, die eine starke kontraktile Reaktion hervorrufen (Abbildung 5A, Zusatzdatei 8). Obwohl hier präzise Stimulationsparameter beschrieben werden (Abbildung 5B), um die Muskulatur maximal zu aktivieren, kann das Protokoll geändert werden (durch Änderung der aktuellen Amplitude, Frequenz, Pulsdauer usw.), um die Muskelaktivierung und die Trainingsdosierung zu steuern. Somit bietet die aktuelle Methode einen kontrollierten Aktivitätsreiz mit standardisiertem Verhalten zwischen den Aktivitätskämpfen und überwindet damit eine wichtige Einschränkung der aktuellen Tiermodelle der Übung¹⁸.

Die beschriebenen Methoden zeigen das Potenzial der Verwendung von Zebrafischlarven zur Untersuchung verschiedener Aspekte des Muskelwachstums (z. B. Hyperplasie und Hypertrophie). Insbesondere die Myogenese in Zebrafischlarven erweist sich durch pharmakologisch induzierte Inaktivität und elektrisch induzierte Kontraktilität als analysefähig. Der Ansatz ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen, durch die körperliche Aktivität zu Muskelwachstum in vivo führt.

Abbildung 1: Aufbau einer Stimulationskammer zur Wiedereinführung der elektrischen Muskelaktivität in Zebrafischlarven. Eine mit Elektroden ausgestattete 6-Well-Zellkulturplatte ermöglicht die Pflege von Larven in Vertiefungen, die aus 2% Agarosegel bestehen. Benutzerdefinierte 4-Well-Kämme werden hergestellt, um rechteckige Vertiefungen (Abmessungen wie angegeben) in Agarose zu erzeugen, um die Position und Ausrichtung einzelner Fischlarven beizubehalten und zu verhindern, dass sie die Silberdrähte während eines starken Zuckens bei elektrischer Stimulation berühren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Messung des Muskelvolumens in lebenden Zebrafischen α-Aktin:mCherry-CAAX (A,B,E) oder β-Aktin:HRAS-EGFP transgene Larven (H,I). Larven aus seitlicher Ansicht aufgenommen und dorsal nach oben, von vorne nach links in den oberen Feldern (A, B, E) dargestellt. (A) Bei der 4-Schicht-Methode wurde das Myotomvolumen berechnet, indem die Länge von Somit 17 (L), gemessen zwischen vertikalen Myosepten (VM) auf einer XY-Ebene (blauer Pfeil), mit dem Durchschnitt von drei Querschnittsflächen (CSA) multipliziert wurde, die auf YZ-Ebenen (YZm, YZa und YZp; gestrichelte gelbe Linien) gemessen wurden. (B) Bei der Full-Stack-Methode wurde die Fläche des Somit-17-Myotoms in jeder Scheibe eines ganzen Z-Stapels einer lebenden Zebrafischlarve gemessen (Beispiele gelb umrandet) und die Summe der myotomalen Bereiche mit dem Abstand zwischen den Scheiben multipliziert. (C) Hohe Übereinstimmung zwischen der 4-Slice- und der Full-Stack-Methode. Farben bezeichnen einzelne β-Aktin:HRAS-EGFP (Quadrate) oder α-Aktin:mCherry-CAAX (Kreise) Fische. (D) Das Myotomvolumen ist leicht, aber signifikant größer, wenn es mit der 4-Schicht-Methode berechnet wird. (E) Bei den sich verjüngenden Zebrafischlarven sind mehr vordere Somiten größer als hintere Somiten, gemessen nach der 4-Scheiben-Methode. (F,G) Starke Korrelation zwischen Volumenmessungen, die mit dem Durchschnitt von drei CSA-Abschnitten (4-Schicht-Methode) oder einem einzelnen YZm CSA (2-Schicht-Methode) durchgeführt wurden. p-Werte zeigen Ergebnisse von zweiseitigen t-Tests mit gleicher Varianz (D,G) oder einer Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Tests (E). ns, nicht signifikant. (H) Messung des Volumens, der Länge (L) und der Querschnittsfläche (CSA) des Myotoms 16 von 2 bis 5 dpf in drei einzelnen Fischen (Farben), die β-Aktin:HRAS-EGFP und myog:H2B-mRFP exprimieren. YZm-Bilder des grünen Individuums zu jedem Zeitpunkt sind oben gezeigt. (I) Einzelfaserwachstum, gemessen durch automatisierte Segmentierung mit konstantem Schwellenwert. Ein β-Aktin:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP-Fisch, mosaikartig markiert durch Injektion eines CMV:Cerulean-Plasmids im 1-2-Zellstadium. Eine einzelne Cerulean-markierte Faser in Somit 10 wurde wiederholt mit hochauflösenden XYZ-Stapeln auf einem Zeiss LSM880 gescannt. Die gezeigten Bilder sind repräsentative Einzelscheiben (links) und die Projektion des dreidimensionalen segmentierten Volumens (rechts). Jeder Datenpunkt im Diagramm stellt einen einzelnen Scan derselben Faser bei 3 dpf (0 h), nach 4 h und bei 5 dpf (54 h) dar. Dreifache Scans wurden erstellt und pro Zeitpunkt segmentiert, um die Reproduzierbarkeit zu zeigen. Weiße Pfeilspitzen zeigen auf Faserkerne; Beachten Sie, dass zwei Kerne zwischen 3 und 5 DPF hinzugefügt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Aktivitätsabhängiges Muskelwachstum bei Somit 17. (A) Die Hemmung der Aktivität für 24 h durch Anwendung von Tricain (rosa) zwischen 3 und 4 dpf reduziert das Myotomvolumen sowohl in transgenen Linien als auch in nicht-transgenen Fischen, die mit BODIPY gefärbt sind, im Vergleich zu Vehikelkontrollen an Geschwistern (blau). Volumen quantifiziert nach 4-Schicht-Methode. Die Symbolform zeigt Replikationsexperimente aus verschiedenen Lagen (biologische Replikate) an. Große Symbole bezeichnen Mittelwert- ± REM-Werte. Kleine schwache Symbole zeigen das Volumen einzelner replizierter Larven. (B) Vergleich der Myotomvolumenreduktion bei inaktiven Fischen im Vergleich zu Kontrollgeschwistern, bestimmt durch einmalige Messung des Myotomvolumens bei 4 dpf (nur 4 dpf, oberes Schema) oder Veränderung des Myotomvolumens zwischen 3 und 4 dpf (4/3 dpf, unteres Schema). Jedes Symbol repräsentiert das mittlere Volumen von Myotom 17 in ~ 5 inaktiven Fischen aus einer einzigen Lage geteilt durch das mittlere Myotom 17 Volumen von ~ 5 aktiven Kontrollgeschwistern. (C) Es wurde kein Unterschied in der mittleren Verringerung des Muskelwachstums bei inaktiven Fischen beobachtet, wenn nur mit 4 dpf oder 4/3 dpf gemessen wurde. Die Zahlen innerhalb der Balken stellen die Gesamtzahl der analysierten Fische dar. p-Werte zeigen Ergebnisse einer Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Tests (A) oder eines zweiseitigen t-Tests mit ungleicher Varianz (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Veränderungen des Zellniveaus im Muskelwachstum durch Inaktivität. (A) Schematische Darstellung, wie die Überzählung an VMs aufgrund der Doppelzählung von sich verjüngenden Fasern dort auftritt, wo sich die blauen und roten Myotome treffen. Beachten Sie, dass die durchschnittliche Faseranzahl 6 beträgt, der wahre Mittelwert jedoch 5,5 beträgt. Die korrigierte Zählung ergibt eine bessere Näherung. (B,C) Die Faserzahl (B) und das durchschnittliche Faservolumen (C) sind bei inaktiven (rosa) Larven im Vergleich zu aktiven (bue) Larven reduziert. Die Symbolform zeigt Replikationsexperimente aus verschiedenen Lagen (biologische Replikate) an. Große Symbole bezeichnen Mittelwert- ± REM-Werte. Kleinere schwache Symbole zeigen den Wert einzelner replizierter Larven. Die Zahlen innerhalb der Balken stellen die Gesamtzahl der analysierten Fische dar. (D) Bei einzelnen Larven wurde jedes Faserprofil im Myotom 17 skizziert und CSA bestimmt. Die Kästchen zeigen Mittelwert ± REM. p-Werte zeigen Ergebnisse der Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Tests (B,C) oder des zweiseitigen t-Tests mit gleicher Varianz (D). (E,F) Kumulative Häufigkeitskurven, die die Verteilung der Fasergröße in aktiven Kontrolllarven (blau) und inaktiven (rosa) Larven zeigen. Der Vergleich aller Fasern (E) oder nach Weglassen von vermutlich entstehenden kleinen oder, im alternativen Extrem, großen Fasern (F) zeigt, dass die Zunahme der Fasergröße, nicht die Zunahme der Faserzahl, in erster Linie für das aktivitätsgesteuerte Wachstum des Myotoms verantwortlich ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Eine kurze elektrische Stimulation ruft bei betäubten Zebrafischlarven tetanische Muskelkontraktionen hervor . (A) Sequentielle Bilder (aufgenommen aus dem Video in Supplemental File 8), die zeigen, wie elektrische Stimulation maximale Kontraktionen einer betäubten Larve bei 3 dpf auslöst. Zeitskala in Sekunden. Rote Kästchen zeigen Bewegungen zu Beginn von drei aufeinanderfolgenden 1 s Stimulationszügen an. Jedes Bild hat eine Belichtung von 40 ms. (B) Schematische Darstellung des elektrischen Stimulationsregimes, bei dem alle 5 s ein 1 s Zug von 200 hochfrequenten, 20 V elektrischen Impulsen gegeben wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Schematische Darstellung der aufgenommenen Bilder von perfekt (oben links) und unvollkommen montierten Larven in Bezug auf das Mikroskop-XYZ-Referenzsystem (schwarze Achsen). Myotom (grün), Notochord (gelb), Neuralrohr (braun), gemessene myotomale Parameter (rot), gemessene Notochordparameter (schwarze Pfeile) und mögliche oder tatsächliche Fischrotationen (blau). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Screenshot der Somitlängenmessung aus XY-Bildern in ZEN. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Screenshot der CSA-Messung aus YZ-Bildern in ZEN. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Screenshot der Somitlängenmessung aus XY-Bildern in Fidschi/ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei: Screenshot der Extraktion von Kalibrierungsparametern für YZ-Bilder aus ZEN. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6: Screenshot der Kalibrierung von YZ-Bildern in Fidschi/ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 7: Screenshot der CSA-Messung von YZ-Bildern in Fidschi/ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 8: Repräsentatives Video, das eine Muskelkontraktion zeigt, hervorgerufen durch direkte elektrische Stimulation (Länge 1 s) einer Tricain-betäubten 3 dpf-Larve. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Hier berichten wir über eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung des Muskelvolumens lebender Zebrafischlarven in Stadien oder in genetischen Varianten, bei denen die Pigmentierung kein großes Hindernis für die Bildgebung darstellt und wenn eine vorübergehende Anästhesie und/oder Immobilisierung gut toleriert wird. Während wir die konfokale Laserscanning-Mikroskopie verwendet haben, sind die beschriebenen Ansätze auf die konfokale Spinnscheiben- oder Lichtblattmikroskopie und auf jede andere Methode anwendbar, die Bildstapel auf verschiedenen Fokusebenen erzeugt. Eine Reihe von immer ausgefeilteren Ansätzen zur Schätzung der Gewebegröße und des Zellgehalts wird beschrieben. Jede Methode hat Vorteile und Einschränkungen, von denen wir zeigen, dass sie quantifiziert werden können. Eine wesentliche Einschränkung bei der Untersuchung des Gewebewachstums ist die Schwierigkeit, Wachstumsänderungen in Echtzeit zu analysieren, da sich die Wachstumsraten als Reaktion auf eine Reihe von molekularen oder subzellulären Ereignissen ändern, die durch akut verabreichte Reize katalysiert werden. Darüber hinaus kann individuelle Variation zu Problemen führen, wenn verschiedene Individuen verglichen werden. Der derzeitige Ansatz ermöglicht die Messung des Gewebewachstums über Zeiträume von weniger als einem Tag bei einzelnen lebenden Individuen. Die Anwendung des Ansatzes kann auf Minutenbasis ins Auge gefasst werden.

Die beschriebenen Methoden erlauben Analysen, die bisher nicht praktikabel waren. Mit der 4-Schicht-Methode kann der bildgebende Teil des Muskelwachstumstests an einer Stichprobengröße von etwa 20 Fischen innerhalb einer Stunde von einem geschulten Bediener abgeschlossen werden. Dies steht im krassen Gegensatz zur herkömmlichen Full-Stack-Methode, die für die gleiche Anzahl von Fischen mindestens 3 Stunden dauert (d.h. dreimal länger). Wenn hochauflösende Bilder für nachfolgende subzelluläre Analysen benötigt werden, kann die Full-Stack-Methode leicht 30 Minuten pro Fisch benötigen, was Wachstumstests von Kohorten von Tieren in einem ähnlichen Entwicklungsstadium unmöglich macht. Im Gegensatz dazu ermöglichen die 2- oder 4-Slice-Verfahren eine schnelle Bildaufnahme in hoher Qualität. Was die Bildanalyse betrifft, so sind die Vorteile der 2- oder 4-Schicht-Methode bei der Einsparung von Bedienerzeit (ohne automatisierte Bildsegmentierung) gegenüber der Full-Stack-Methode enorm. Jeder Fisch benötigt etwa 20 Minuten für die Full-Stack-Analyse, aber nur 3-4 Minuten für die 4-Schicht-Analyse. Mit der nahezu ebenso genauen 2-Schicht-Methode kann die Bedienerzeit weiter eingespart werden. Somit ist das beschriebene Verfahren effizient und erhöht dadurch die Flexibilität im Versuchsdesign.

Die Haupteinschränkung der 4- oder 2-Schicht-Methoden besteht darin, dass beide Methoden aufgrund der überlappenden Chevronform von Somiten Schätzungen sind (z. B. das Volumen der Regionen zweier benachbarter Somiten (z. B. Myotom 16 und 17). Es zeigt sich, dass dies das tatsächliche Myotom 17-Volumen um etwa 2% überschätzen kann, je nachdem, wo genau YZ-Schnitte ausgewählt wurden. Darüber hinaus könnte die manuelle Verfolgung der Somitgrenzen während der Messungen zu Abweichungen in den Schätzungen beitragen, obwohl nur geringe Unterschiede zwischen den Experimentatoren gefunden wurden (Daten nicht gezeigt). Messfehler können mithilfe von Schwellenwert-, Filter- und Segmentierungsalgorithmen behoben werden, um die Oberfläche objektiver und reproduzierbarer zu erfassen. Es sind jedoch weiterhin Anpassungen erforderlich, um Schwankungen der Hintergrundfluoreszenz (z. B. aufgrund der Einbettung und/oder Dicke der LMA) und des Expressionsniveaus der Fluoreszenzproteine einzelner Larven im Laufe der Zeit zu berücksichtigen. Beachten Sie, dass solche automatisierten Messungen noch schwieriger sind, wenn ein nicht muskelspezifischer Reporter wie die β-actin:HRAS-EGFP-Linie verwendet wird. Unter vielen Umständen, zum Beispiel beim Vergleich der Auswirkungen von Manipulationen zwischen Fischen, die verschiedenen Behandlungen unterzogen wurden, von denen erwartet wird, dass sie das gesamte Muskelgewebe betreffen, kann die Ungenauigkeit jedoch unerheblich sein. Wenn jedoch maximale Genauigkeit für den Vergleich mit Faser- oder Kernzahlen erforderlich ist, die beispielsweise ausschließlich aus Myotom 17 gezählt werden, können die "Slice"-Methoden verbessert werden. Dies kann entweder durch die mühsame Full-Stack-Methode, durch mathematische Korrektur durch Multiplikation der gemessenen 4-Schicht-Volumina mit 0,98 oder durch Verschieben der Position der YZ-CSA-Scans nach hinten erreicht werden, um die wahre CSA von Myotom 17 genauer widerzuspiegeln.

Eine zweite Einschränkung der Methode ist ihre Empfindlichkeit gegenüber der Montageausrichtung der Fische. In der Praxis können erfahrene Bediener Fische die meiste Zeit in vernünftigen Grenzen orientieren, selbst wenn sie schnell arbeiten, um viele Proben einzubetten. Modifikationen an der Ausrüstung am Mikroskoptisch sind denkbar, die eine Korrektur von Gier- und Walzen vor dem Scannen ermöglichen. Ohne eine solche Vorrichtung wird ein Verfahren zur Quantifizierung von Fehlorientierungen beschrieben, mit dem dann die gemessenen Volumina korrigiert werden können. Selbst wenn eine Fehlorientierung die Variabilität des gemessenen Volumens erhöht und somit die Wahrscheinlichkeit verringert, kleine Effektstärken zu beobachten, wirkt sich eine solche Variation in vielen Situationen in ähnlicher Weise auf Kontroll- und experimentelle Proben aus. Daher sind falsch positive Ergebnisse unwahrscheinlich, wenn sich die Betreiber des Problems bewusst sind.

Die beschriebenen Methoden wurden ursprünglich angewendet, um die Rolle der elektrischen Aktivität beim Muskelwachstum zu analysieren, ein Thema mit einer langen Geschichte der Analyse in einer Vielzahl von Arten (überprüft in¹⁸). Dazu werden einfache Methoden zur Blockierung der endogen ausgelösten Aktivität detailliert beschrieben und durch eine kontrollierte gemusterte elektrische Stimulation in der Zebrafischlarve ersetzt. Vorteile dieses Ansatzes sind die Entfernung neuronaler Rückkopplungskontrollen⁴⁰, die Eliminierung der Auswirkungen einer veränderten Ernährung und die Fähigkeit, circadiane Effekte auf das Wachstum selbst zu analysieren, anstatt auf Wachstumsproxies wie den Proteinumsatz²⁶. Da unterschiedliche Muster elektrischer Aktivität unterschiedliche Muskelreaktionen auslösen und den Fasertyp, die Größe und den Stoffwechsel regulieren 41,42,43,44,45,46,47,48^, öffnen die aktuellen Methoden den Zebrafisch für solche Analysen.

Die beschriebenen Methoden bieten eine Reihe von Techniken, mit denen viele Aspekte der Muskelphysiologie, Zellbiologie und Pathologie in beispielloser zeitlicher und räumlicher Auflösung analysiert werden können, indem der relativ unerforschte Zebrafisch genutzt wird. Die derzeitigen Ansätze ließen sich eindeutig auf andere Arten, Körperregionen und Entwicklungsstadien übertragen. Das schnelle frühe Wachstum von Zebrafischlarven macht den Nachweis akuter Auswirkungen von Manipulationen auf das Gewebewachstum und die Morphogenese besonders attraktiv. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Zebrafischmuskeln verschiedene Wachstumsmechanismen und Kontrollen mit Säugetieren teilen. Während Zebrafische Wirbeltiere sind, die viele Aspekte der Muskelmolekulargenetik, Zell- und Entwicklungsbiologie mit dem Menschen konservieren, gibt es auch signifikante Unterschiede in der Kontrolle des Muskelwachstums. Zum Beispiel sind langsame und schnelle Fasertypen bei Fischen räumlich deutlicher getrennt und die Innervation der Muskeln zeigt Unterschiede. Weiterhin ist zu berücksichtigen, dass wir bisher nur die frühen Entwicklungsstadien analysieren konnten. Ähnliche Analysen in späteren Phasen sind vorgesehen.