Caenorhabditis elegans 아세틸콜린 수용체 작용제 Levamisol에 대한 민감도 측정

1. 레바미솔 분석용 플레이트의 제조 교반 막대가 있는 플라스크에서 3 g의 NaCl, 2.5 g의 펩톤 및 17 g의 한천을 1 L의 탈이온화(DI) 물과 조합함으로써 선충류 성장 배지(NGM) 배지를 제조하였다. 오토클레이빙 후, 배지를 70°C로 설정된 핫플레이트 상에 놓고 1 h 동안 적당한 속도로 교반한다. 침전을 방지하기 위해 5 mg/mL 콜레스테롤 1 mL, 1 MCaCl2 1 mL, 1 M MgSO4 1 mL, 및 25 mL의 1 M pH 6.0 인산칼륨 완충액을 배지에 적가하십시오. NGM 배지 2mL를 멸균 혈청학적 피펫이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 옮깁니다(그림 1). 박테리아로 씨를 뿌리기 전에 접시를 벤치 탑에서 2 일 동안 말리십시오. 장기간 보관하려면 4 °C에 두십시오. OP50 대장균 을 리소겐 브로스(LB) 플레이트 상에 스트레킹하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 단일 OP50 콜로니를 B-브로스 (1 L의DIH2O중 트립톤 10 g 및 5 g의 NaCl)에 넣고 밤새 37°C에서 진탕 배양물을 설정하였다. 멸균 피펫을 사용하여 30 μL의 OP50 현탁액을 각 웰의 중앙에 있는 한천 상에 떨어뜨린다(그림 1).참고 : 한천 표면이 웜 굴로 이어질 수 있으므로 손상시키지 마십시오. 박테리아 잔디밭이 형성 될 수 있도록 파종 후 적어도 2 일 동안 플레이트를 실온에서 앉히십시오.참고: 중앙 웰의 박테리아가 2일 후에도 건조되지 않으면 플레이트를 후드에서 20분 동안 열어 두십시오(그림 1). 플레이트는 분석 1-2 주 전에 박테리아를 부어 뿌려야합니다. 2. C. elegans 동기화 (1 일째) 야생형, unc-63 (x26), lev-10 (x17) 및 unc-49 (e407) C. elegans 를 6cm 플레이트에서 성인으로 성장시켜 균주 당 적어도 8 개의 플레이트를 준비하십시오. 접시에 굶주리지 않은 gravid 성인이 많이 있는지 확인하십시오.참고 : 이것은 필요한만큼 두 배나 많은 플레이트입니다. 그러나 표백 중에 계란의 첫 번째 배치가 파괴 될 경우를 대비하여 백업 플레이트를 갖는 것이 중요합니다. 교반하면서 59.6 g의Na2HPO4(이염기성), 29.9 g의 KH2PO4 (단염기성),12.8g의 NaCl, 및 2.5 g의 MgSO4를 교반하면서 DI 물 750 mL에 용해시켜 10x M9 완충액을 만든다. 일단 용해되면 부피를 1L까지 가져 와서 필터를 멸균하십시오. 1:10을 희석하고 오토클레이브하여 1x M9 버퍼를 만듭니다.참고: 1x M9 버퍼는 몇 주 또는 몇 달 전에 만들 수 있습니다. 동기화 당일에 후드 아래에 표백 용액을 준비하십시오. 표백제 10mL(표 자료), 2.5mL의 10N NaOH 및 37.5mL의 DI 물을 50mL 원뿔형 튜브에 섞는다. 표백 용액으로 작업 할 때마다 고글, 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 1x M9 버퍼로 적어도 네 개의 플레이트에서 gravid 성인 웜을 씻어 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 1분 동안 716 x g 에서 스핀한 다음, 전사 피펫을 사용하여 상청액을 제거하였다. 표백 용액 10 mL를 첨가한다. 웜 시체의 대부분이 녹을 때까지 튜브를 뒤집거나 부드럽게 흔들어 ~ 4 분 동안 흔들어 라.참고 : 웜을 과도하게 표백하지 않도록주의하십시오.이 웜은 알을 파괴 할 것입니다. 특정 돌연변이는 계란 분리의 어려움을 증가시킬 수 있습니다. 1 분 동안 716 x g 에서 회전하십시오. 표백제 용액을 한 동작으로 붓습니다. 이 시점에서 튜브가 흔들리지 않는 한, 계란은 튜브의 측면에 달라 붙을 것입니다. 15mL의 1x M9 버퍼를 추가하고 반전시킵니다. 716 x g 에서 1분 동안 회전하고 M9 버퍼를 한 번의 부드러운 동작으로 붓습니다. 단계 2.9에 설명된 대로 1x M9 버퍼로 총 세 번의 세척을 수행합니다. 최종 세척 후, 신선한 1x M9 10 mL를 첨가하고, 15°C에서 하룻밤 동안 회전기 상에 놓고, 굶주린 제1 유충(L1) 단계 동물의 동기화된 집단을 분리한다.참고: 회전기를 착용하기 전에 M9 버퍼에 계란이 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 백업 플레이트와 표백제로 준비를 더 짧은 시간 동안 반복하십시오. 3. 도금 동기화 된 C. elegans (2 일째) 24웰 플레이트 맵을 인쇄하고 무작위 장소에 균주를 할당합니다. 각 균주는 24-웰 플레이트에 적어도 여섯 번 나타내야 한다. 표백제 준비 후 약 24시간 후, 부화한 굶주린 L1 웜을 실온에서 1분 동안 716 x g 의 M9 버퍼로 스핀다운한다. 플라스틱 이송 피펫으로 ~9mL의 M9 버퍼를 제거한 다음, 굶주린 첫 번째 애벌레 단계 웜(L1s)을 나머지 M9 버퍼에 부드럽게 섞는다. 즉시 M9 완충액 중의 웜 3 μL를 현미경 슬라이드 상에 피펫팅하고 L1s의 수를 결정하고; 원하는 수는 3 μL에서 20-30 L1s입니다. 웜 농도가 너무 낮 으면 M9를 내리고 M9를 제거하고 농도가 너무 높으면 M9를 추가하십시오.참고: 3μL당 웜 수를 최소 2배 이상 확인하고 매번 튜브를 뒤집습니다. 미리 만들어진 플레이트 맵에 따라 3 μL의 L1s(총 20-30개의 웜)를 각 웰에 피펫팅한다(단계 3.1; 그림 1).참고: M9의 L1로 튜브를 자주 반전시켜 웜이 바닥에 정착할 때 균일한 분포를 유지합니다. 이것이 완료되지 않으면 일부 우물에는 너무 적은 웜이 있고 다른 우물에는 너무 많은 웜이 있습니다. 또한 피펫 팁으로 한천을 관통하지 마십시오.이 경우 동물이 파묻히게됩니다. 웜이 20 °C에서 3 일 동안 성인기까지 자라게하십시오.참고 : 다른 성장 온도와 특정 돌연변이를 사용하면 성숙 속도에 영향을 줄 수 있으므로 C. elegans 수명주기를 고려해야합니다. 4. 레바미솔 분석 수행(5일째) 빈 데이터시트를 인쇄하면 1시간 동안 5분마다 각 웰에서 이동하는 웜의 수를 기록하는 데 사용됩니다.참고 : 학생들은 5 분마다 최대 12 개의 우물에서 웜을 계산할 수 있습니다. 상위 12개의 웰은 첫 번째 시간에 분석되고, 하위 12개의 웰은 다음 시간에 분석됩니다. 24 웰 플레이트의 웜을 확인하십시오. 마커를 사용하여 오염이 있거나, 굶주리거나, 너무 많은 웜 (>40)이있는 우물 위에 플레이트 뚜껑에 “X”를 만들어 계산이 어려워집니다. 1x M9의 50 mL에 100 mM 레바미솔 스톡 200 μL를 첨가하여 0.4 mM 레바미솔 용액을 만든다. 240.76 mg의 레바미솔 염산염을 10 mL의H2O에 용해시켜 100 mM 레바미솔 스톡을 제조하고 이를 -20°C에서 보관한다.참고 : Levamisol은 M9에서 희석해야합니다. H2O에서의 희석은 마비를 가속화한다. 학생들은 장갑을 착용해야합니다. 고농도의 레바미솔을 섭취하는 것은 독성이 있습니다. 타이머를 시작한 다음 트랜스퍼 피펫을 사용하여 1 mL의 0.4 mM 레바미솔을 처음 두 웰에 첨가하여 동물들이 자유롭게 수영하도록하십시오. 인접한 웰에 레바미솔을 계속 첨가하고, 분석될 웰의 수에 따라 시간을 비틀어씁니다.참고: 예를 들어, 10개의 웰이 분석되는 경우, 레바미솔은 다음과 같은 방식으로 첨가될 것이다: 웰 1 및 2는 시간 0, 웰 3 및 4는 1분 후, 웰 5 및 6은 2분 후, 웰은 3분 후에 웰 7 및 8, 웰은 4분 후에 웰 9 및 10이다. 5분에 첫 번째 웰부터 시작하여 각 웰에서 움직이는 웜의 수만 수동으로 계산하고 데이터시트에 해당 숫자를 기록합니다(그림 1). 카운터는 사용할 수 있지만 움직이는 웜의 수를 정확하게 결정할 필요는 없습니다.참고 : 학생들은 많은 웜이 마비되기 전에 초기 시간대에 때때로 뒤쳐지기 때문에 타이머를 주시해야합니다. 시간 포인트의 수를 조정할 수 있거나, 필요한 경우 각 시점에서 더 적은 웰을 분석할 수 있습니다. 1 시간 동안 5 분마다 각 우물에서 움직이는 웜의 수를 계속 계산하십시오.참고: M9에 침지하면 이 1시간 분석 과정에서 지속적인 수영 운동이 유도되므로 마비를 평가하기 위해 웜을 엿볼 필요가 없습니다(그림 2A). 0.4 mM 레바미솔 용액에 대한 노출은 수영의 중단에 의해 관찰되는 바와 같이 시간 의존적 마비를 유도한다; 마비 된 웜은 회복되지 않습니다. 4.4.-4.6단계를 반복합니다. 접시에있는 우물의 나머지 부분. 분석이 끝날 때 또는 시간이 허락하면 각 웰의 총 웜 수를 기록하십시오. 5. 데이터 분석 플레이트 맵을 획득하고(단계 3.1.) 각 웰에 해당하는 변형을 기록한다.참고: 수집된 데이터의 양으로 인해 데이터에 대한 후속 분석 및 토론에는 최소 몇 시간이 소요됩니다. 데이터를 스프레드시트에 입력하고, 각 웰의 총 웜 수부터 시작하여 유전자형별로 구성합니다. 우물에서 데이터를 결합하여 모든 균주에 대해 각 시점에서 이동하는 웜의 수를 결정합니다. 이러한 데이터를 사용하여 통계 소프트웨어(Table of Materials)에서 “생존 곡선”을 작성하여 집단의 시간 의존적 마비를 시각적으로 표시합니다(그림 2B). 왼쪽 열은 시간을 나타내고 후속 열에는 각 변형에 대한 데이터가 포함되도록 데이터 테이블을 만듭니다. 처음 5 분 이내에 마비 된 각 동물에 대해 행을 만들고 5 분 동안 “1”을 입력하십시오. 각 시점에 대해 이 작업을 반복합니다. 분석이 끝날 때까지 마비되지 않는 모든 동물의 경우 60 분 동안 “0”을 입력하십시오. 통계 소프트웨어(Table of Materials)에서 로그-랭크(Mantel-Cox) 검정을 사용하여 쌍 비교를 수행하여 두 균주 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는지 확인합니다. 추가/대체 분석을 위해 5.3단계를 수행하는 대신 수행합니다. 단계 5.4., 각 시점에서 각 웰에서 이동하는 동물의 백분율을 결정한다. 스프레드시트 프로그램 또는 통계 소프트웨어를 사용하여 분석된 모든 균주에 대해 각 시점에서 표준 오차가 있는 평균을 플로팅합니다(그림 2C).