Misurazione della Caenorhabditis elegans Sensibilità al levamisolo agonista del recettore dell'acetilcolina
Summary
Il presente protocollo descrive un test per determinare la risposta al levamisolo, un agonista farmacologico di una classe di recettori dell’acetilcolina di Caenorhabditis elegans . In questo test di nuoto di levamisolo liquido, i ricercatori osservano visivamente e quantificano la paralisi dipendente dal tempo degli animali coltivati in piastre a 24 pozzetti.
Abstract
Alla giunzione neuromuscolare (NMJ), il legame del neurotrasmettitore eccitatorio acetilcolina (ACh) ai recettori postsinaptici porta alla contrazione muscolare. Come nel muscolo scheletrico dei vertebrati, la segnalazione colinergica nei muscoli della parete corporea dell’organismo modello Caenorhabditis elegans è necessaria per la locomozione. L’esposizione al levamisolo, un agonista farmacologico di una classe di recettori ACh sui muscoli della parete corporea, provoca la paralisi dipendente dal tempo degli animali selvatici. L’alterata sensibilità al levamisolo suggerisce difetti nella segnalazione alla NMJ o alla funzione muscolare. Qui viene presentato un protocollo per un saggio di levamisolo liquido eseguito su C. elegans coltivati in piastre a 24 pozzetti. Il nuoto vigoroso degli animali nel liquido consente la valutazione e la quantificazione della paralisi indotta dal levamisolo in centinaia di vermi per un periodo di tempo di un’ora senza richiedere una manipolazione fisica. Questa procedura può essere utilizzata sia con wild-type che con mutanti che hanno alterato la sensibilità al levamisolo per dimostrare le conseguenze funzionali della segnalazione alterata al NMJ.
Introduction
L’attivazione dei recettori postsinaptici dell’acetilcolina (AChR) sul muscolo scheletrico provoca un segnale elettrico che porta alla contrazione muscolare. L’interruzione della funzione neuromuscolare provoca sindromi miasteniche e distrofie muscolari nell’uomo 1,2,3,4. Il nematode Caenorhabditis elegans è stato ampiamente utilizzato per conoscere i processi biologici fondamentali evolutivamente conservati e i meccanismi della malattia. I muscoli scheletrici dei vertebrati e i muscoli della parete corporea di C. elegans sono funzionalmente equivalenti nel controllo della locomozione5. Qui viene presentato un semplice saggio che può essere utilizzato per confrontare C. elegans wild-type con mutanti che hanno alterato la segnalazione neuromuscolare o la funzione muscolare.
Gli input eccitatori e inibitori ricevuti rispettivamente dai motoneuroni colinergici e GABAergici causano la contrazione dei muscoli su un lato del corpo di C. elegans mentre i muscoli sull’altro lato si rilassano, consentendo la locomozione coordinata6. Il levamisolo, un agente antielmintico usato per trattare le infezioni da nematodi parassiti, si lega e attiva costitutivamente una classe di AChR sui muscoli della parete corporea, con conseguente paralisi dipendente dal tempo7. Pertanto, l’alterata sensibilità al levamisolo può essere utilizzata per identificare C. elegans con difetti nell’equilibrio della segnalazione eccitatoria e inibitoria 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Ad esempio, mutazioni in subunità dell’AChR (L-AChR) sensibile al levamisolo, come UNC-63, così come l’omologo di C. elegans di Cubilin, LEV-10, che è richiesto per il raggruppamento di L-AChR nella sinapsi, influenzano la segnalazione eccitatoria e provocano resistenza al levamisolo 7,8. Le mutazioni nel recettore GABAA UNC-49 riducono la segnalazione inibitoria e causano ipersensibilità al levamisolo12.
L’ipersensibilità o la resistenza al levamisolo è stata tradizionalmente valutata trasferendo gli animali in piastre di agar contenenti levamisolo e quindi pungolando regolarmente i vermi per determinare il punto temporale in cui si verifica la paralisi13,14,15. Abbiamo sviluppato un test di nuoto in levamisolo liquido che elimina la necessità di manipolazione fisica degli animali e consente lo screening di centinaia di animali in solo 1 ora. Qui viene descritto l’uso di questo test con animali wild-type, unc-63 (x26), lev-10 (x17) e unc-49 (e407). Tuttavia, questo protocollo può essere eseguito anche su C. elegans esposti a RNAi, come è stato fatto per convalidare i knockdown identificati in uno screening RNAi a livello di genoma per l’alterata sensibilità al levamisolo11.
Per questo test farmacologico, i vermi sono cresciuti fino all’età adulta in piastre a 24 pozzetti, 0,4 mM di levamisolo in tampone M9 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e il numero di animali in movimento è stato registrato ogni 5 minuti per 1 ora. La paralisi indotta da levamisolo è stata osservata visivamente nel tempo e, dopo il completamento del test, i dati sono stati quantificati. La valutazione dei mutanti insieme al tipo selvatico C. elegans consente agli studenti di fare prima previsioni sui potenziali effetti fenotipici e quindi eseguire esperimenti per testare le loro ipotesi. In conclusione, questo semplice e economico saggio di levamisolo liquido è un modo ideale per dimostrare l’impatto della perdita di geni specifici sulla funzione NMJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
La risposta alterata al levamisolo può identificare i geni necessari per la segnalazione colinergica postsinaptica e la funzione muscolare. Il protocollo qui descrive un saggio di levamisolo liquido utilizzato per quantificare la paralisi dipendente dal tempo per un periodo di tempo di 1 ora. Gli studenti fanno previsioni sugli effetti di alcune mutazioni genetiche, conducono un esperimento con campioni di grandi dimensioni e quindi quantificano i loro risultati. Questo test è un modo semplice ed efficace per quantificare la paralisi indotta dal levamisolo senza raccogliere o pungolare gli animali, rendendolo adatto ai laboratori universitari e ai ricercatori che studiano la trasmissione neuromuscolare. Qui vengono discusse alcune delle insidie più comuni, i limiti del test e una variazione al protocollo che ne consente l’uso con animali knockdown RNAi; Qui viene anche discusso come questo test può essere incorporato in un’esperienza di ricerca universitaria basata sul corso.
La corretta preparazione delle piastre a 24 pozzetti è essenziale. In primo luogo, i prati batterici devono essere completamente asciutti prima di individuare gli animali L1 nei pozzi. Se non abbastanza essiccato, i batteri si mescolano con la soluzione di levamisolo durante il test, rendendo il liquido torbido e impedendo agli individui di essere in grado di contare i vermi. In secondo luogo, quando si sincronizzano i vermi attraverso la preparazione della candeggina, gli animali non devono essere esposti alla soluzione di candeggina per troppo tempo in quanto ciò causerebbe la disintegrazione del rivestimento protettivo sulle uova. In terzo luogo, è fondamentale individuare solo 20-30 L1 per pozzo, poiché troppi vermi nei pozzi rendono estremamente difficile contare con precisione il numero che si muove nel tempo assegnato. Infine, è importante mantenere una tecnica asettica durante la preparazione delle piastre poiché i pozzi contaminati non possono essere analizzati.
Ci sono alcune limitazioni che devono essere considerate quando si esegue questo test. In primo luogo, contare il numero di worm in movimento in ogni pozzetto ogni 5 minuti può essere travolgente per le persone che non hanno precedenti esperienze di laboratorio, e questo potrebbe portare a una raccolta di dati imprecisa. Come per altri saggi utilizzati per determinare la sensibilità al farmaco18,19, questo esperimento può essere eseguito con meno punti temporali. In secondo luogo, la placcatura di L1 affamate isolate da una preparazione di candeggina è un metodo semplice per ottenere una popolazione sincronizzata; Tuttavia, è necessario apportare modifiche se i tempi di sviluppo differiscono tra i ceppi analizzati. È possibile prelevare animali del quarto stadio larvale (L4) in una piastra a 24 pozzetti per questo test; Tuttavia, quando si preparano molti piatti, questo è troppo laborioso. In alternativa, si dovrebbe determinare il tempo necessario affinché ogni ceppo raggiunga L4 e quindi posizionare gli L1 nei pozzetti in momenti diversi per regolare le differenze nella velocità di maturazione. Infine, mentre questo test può essere utilizzato per identificare nuovi geni importanti per la funzione muscolare postsinaptica11, l’alterata risposta del levamisolo può anche essere causata da mutazione o knockdown RNAi dei geni presinaptici12. Se si osserva un’alterata sensibilità al levamisolo, devono essere eseguiti ulteriori esperimenti per determinare la ragione di questo fenotipo.
Apportando alcune modifiche alle piastre a 24 pozzetti, il saggio di nuoto del levamisolo descritto può essere eseguito anche su animali abbattuti dall’RNAi11. Il knockdown genico attraverso RNAi può essere ottenuto alimentando i batteri C. elegans che esprimono RNA a doppio filamento corrispondente al gene di interesse20. Per la preparazione di piastre di RNAi, devono essere aggiunti 1 mL di IPTG 1M e 1 mL di carbenicillina da 25 mg/ml per litro di terreno dopo la rimozione dall’autoclave. Le colture batteriche vengono coltivate raccogliendo una singola colonia in 3 ml di brodo LB più 3 μL di 25 mg / mLcarbenicillina e agitando a 37 ° C durante la notte, e la mappa della piastra viene fatta quando i diversi batteri vengono individuati nei pozzetti. C. elegans sono sincronizzati dalla preparazione della candeggina come descritto; tuttavia, il ceppo eri-1 (mg366) ipersensibile all’RNAi dovrebbe essere usato al posto del wild type per aumentare il knockdown genico. I knockdown di RNAi producono gli stessi fenotipi di levamisolo osservati per i mutanti con perdita di funzione11.
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato nella ricerca di laboratorio, come esperimento autonomo nel laboratorio universitario o nelle prime settimane di un corso di laurea avanzato come introduzione alle tecniche di base di C. elegans e alla funzione neuromuscolare. In un corso più avanzato basato sulla scoperta, gli studenti possono utilizzare questo test per determinare se la perdita di omologhi di C. elegans di geni mutati in individui con sindromi miasteniche, distrofie muscolari o miopatie altera la sensibilità del levamisolo. In conclusione, questo semplice ed economico test di sensibilità al levamisolo fornisce un approccio pratico per apprendere la segnalazione presso l’NMJ e acquisire esperienza lavorando con il sistema modello di C. elegans.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Riya Dattani e Lauren Hogstrom, che hanno raccolto i dati in Figura 2B,C ciechi al genotipo nel BISC413 Advanced Genetics Laboratory (Spring 2022) presso l’Università del Delaware. Ulteriori informazioni sull’esperienza di ricerca universitaria basata sul corso BISC413 (CURE), nonché l’accesso al manuale di laboratorio progettato da J. Tanis, sono disponibili su richiesta. I ceppi di nematodi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è supportato dal NIH-ORIP (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da un P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (a J.E.T.).
Materials
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
Referencias
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