Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

A capacidade de visualizar interações proteína-DNA no nível de molécula única e em tempo real forneceu uma visão significativa da estabilidade do genoma ^1,2. Além de trabalhar com moléculas individuais de DNA, uma de cada vez, a capacidade de visualizar transações entre moléculas individuais próximas fornece informações adicionais ^3,4,5. A manipulação de moléculas adicionais de DNA requer armadilhas ópticas adicionais, bem como células de fluxo microfluídico multicanal de alta qualidade⁶.

Existem vários métodos disponíveis para gerar mais de um trap óptico. Estes incluem espelhos de varredura de galvanômetros, moduladores ópticos acústicos e óptica difrativa, que geram pinças ópticas holográficas 4,7,8,9. Muitas vezes, espelhos de varredura e moduladores ópticos acústicos produzem armadilhas que compartilham o tempo. Na configuração descrita aqui, o feixe de um único laser Nd:YAG é dividido na polarização e, em seguida, os espelhos de varredura a laser galvanômetro controlam a posição do que é chamado de armadilha móvel (Figura 1)⁴. Para facilitar o posicionamento de espelhos e filtros para direcionar o feixe de retenção para a abertura traseira da objetiva do microscópio, um laser HeNe é usado. Isso facilita o alinhamento geral, pois o feixe HeNe é visível a olho nu, enquanto os feixes infravermelhos não são. O feixe HeNe também é mais seguro de trabalhar, tornando o posicionamento de espelhos e outros componentes menos estressante. Inicialmente, o caminho do feixe para este laser é separado do feixe de 1064 nm, mas é introduzido no mesmo caminho do feixe e, em seguida, na objetiva do microscópio. Uma vez que o alinhamento físico é alcançado, o posicionamento do feixe de 1064 nm no topo do feixe HeNe é feito e isso é facilitado pelo uso de um visualizador infravermelho e várias ferramentas de imagem do feixe para visualizar a posição e a qualidade do feixe. Em seguida, o expansor de feixe é introduzido e o feixe infravermelho expandido resultante é alinhado na abertura traseira do objetivo. Finalmente, a objetiva é removida e a potência em cada feixe polarizado é medida e ajustada usando placas de onda λ/2 para ser igual (Figura 1C). As medições de energia também são feitas uma vez que o objetivo é retornado e, normalmente, há uma perda de energia de 53%. Há, no entanto, energia suficiente para formar armadilhas ópticas fixas e móveis estáveis no plano focal (Figura 1D).

Para as transações de DNA de imagem, as células de fluxo microfluídico desempenham um papel fundamental, pois permitem medições controladas no nível de molécula única com alta resolução espacial e temporal (Figura 2). O termo microfluídico refere-se à capacidade de manipular fluidos em um ou mais canais com dimensões que variam de 5 a 500 μm^10,11. O termo fluxo refere-se ao fluido real dentro de um canal e o canal refere-se ao canal físico no qual um fluxo ou fluxos de fluido se movem. O design de células de fluxo de canal único tem um canal físico comum onde as reações são observadas e normalmente há apenas um fluxo de fluido presente. Assim, esses projetos são conhecidos como células de fluxo único. Em contraste, as células de fluxo multifluxo são definidas como um dispositivo microfluídico no qual dois ou mais canais de entrada convergem em um único canal físico comum (Figura 2A). Dentro do canal comum, os fluxos de fluido que se originam dos canais individuais fluem paralelamente uns aos outros e permanecem separados com apenas uma mistura mínima entre eles ocorrendo devido à difusão (Figura 2B). Na maioria das configurações experimentais, uma única bomba empurra fluidos para cada canal na mesma velocidade. Em contraste, quando a direção de limite é usada, três ou mais bombas controladas independentemente empurram fluidos através dos canais. No entanto, cada bomba opera a uma velocidade diferente, mas a taxa de fluxo líquido no canal comum é constante¹². Isso permite a troca rápida de componentes do canal principal simplesmente alterando a velocidade da bomba.

Além do fluxo laminar, outro fator crítico é o perfil de velocidade parabólica dentro do fluxo de fluido laminar. A maior velocidade de escoamento ocorre no meio do fluxo e a mais lenta ocorre junto às superfícies (Figura 2C)¹³. Este perfil deve ser considerado para esticar completamente uma molécula de DNA que está ligada a uma conta mantida no fluxo para visualização precisa do DNA fluorescente e análises precisas de molécula única. Aqui, o DNA é esticado para a forma B e é mantido no lugar sob 0 pN de força. Para conseguir isso, o foco da posição do purgador óptico deve estar a uma posição de 10-20 μm da superfície inferior da tampa (Figura 2D). Deve-se tomar cuidado para que a molécula de DNA não seja esticada além da forma B, pois isso pode inibir as reações enzimáticas. Sob condições típicas de tampão, 1 μm = 3.000 pb de DNA¹⁴. Além disso, ao prender 10-20 μm da lâmina de cobertura, o complexo de DNA é posicionado longe da superfície, minimizando assim as interações superficiais.

Muitos métodos têm sido utilizados para criar canais de dispositivos microfluídicos e estes podem ser feitos em laboratório ou células de fluxo podem ser adquiridas de fontes comerciais 6,15,16,17. Os materiais ideais utilizados para a construção das células de fluxo devem ser mecanicamente rígidos, opticamente transparentes com baixa fluorescência e impermeáveis a solventes orgânicos⁶. Frequentemente, o vidro float de borossilicato ou a sílica fundida são usados para fornecer um ambiente de fluxo estável por um tempo prolongado que é adequado para aprisionamento óptico, visualização e detecção de força. Esses materiais também permitem o uso de solventes não aquosos (por exemplo, metanol de grau espectrofotométrico) para simplificar a umectação da superfície e a remoção de bolhas de ar e desnaturantes (por exemplo, cloridrato de guanidínio 6M) ou detergentes para limpar a célula de fluxo. Finalmente, os métodos utilizados para introduzir fluidos em células de fluxo variam de sistemas complexos de bomba de vácuo a bombas de seringa única 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Na abordagem descrita aqui, é utilizada uma bomba de seringa que pode acomodar até 10 seringas (Figura 3A). Isso fornece flexibilidade para usar células de fluxo de canal único ou células de fluxo com vários canais de entrada. Aqui, uma célula de fluxo de três canais é usada e é acoplada a seringas mantidas no lugar na bomba da seringa usando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). O fluxo de fluidos é controlado por válvulas de comutação de quatro vias e, assim, servem para minimizar a introdução de bolhas na célula de fluxo (Figura 3A,D). Além disso, seringas à prova de gás Hamilton, que possuem paredes de vidro rígidas e êmbolos revestidos com politetrafluoroetileno (PTFE), são recomendadas, pois proporcionam um movimento de êmbolo excepcionalmente suave, essencial para a obtenção de um fluxo suave^14,27.

No sistema experimental descrito, foram utilizadas células de fluxo com dois a cinco canais de entrada. O número de canais de entrada é ditado pelo experimento que está sendo feito. Para o estudo de RecBCD e Hop2-Mnd1, dois canais de fluxo foram suficientes^14,28. Para a helicase, a enzima foi ligada à extremidade livre do DNA e traduzida em um fluxo contendo magnésio e ATP para iniciar a translocação e o desenrolar. Para Hop2-Mnd1, o DNA opticamente aprisionado foi traduzido para a corrente fluida adjacente contendo proteínas e tampão ± íons metálicos divalentes. O uso de células de fluxo de três canais permite prender o DNA no fluxo 1, traduzir o DNA no fluxo 2 para permitir que a ligação às proteínas ocorra e, em seguida, transmitir o fluxo 3 onde o ATP está presente, por exemplo, para iniciar reações. Uma variação do acima é usar proteína marcada com fluorescente no canal 2, o que resulta no fluxo de fluido sendo completamente branco e impede a visualização do DNA. Quando esta molécula é traduzida em fluxo 3, tanto as proteínas quanto o DNA são agora visíveis quando as reações são iniciadas.

O uso de válvulas de comutação de quatro vias para controlar o fluxo de fluido é um componente crítico do sistema para eliminar bolhas nas células de fluxo. As bolhas são prejudiciais ao fluxo estável de fluidos à medida que se contraem e se expandem de maneiras imprevisíveis, resultando em mudanças rápidas na velocidade do fluxo e na introdução de turbulência. Quando as válvulas são posicionadas entre as seringas e a tubulação de entrada, o caminho do fluxo é desconectado alternando a posição da válvula quando as seringas são trocadas. Quando a nova seringa é colocada no lugar, o êmbolo pode ser pressionado manualmente para que >6 μL seja ejetado (o volume morto da válvula) e isso elimina as bolhas quase inteiramente.

A fixação de conectores a células de fluxo é frequentemente a etapa de limitação de taxa no uso de células de fluxo. Descrevemos o uso de dois tipos de conectores: removíveis conhecidos como press-fit e permanentes (conjuntos de nanoportas). Os conectores removíveis são simples de aderir a uma célula de fluxo e diferentes tipos de tubos flexíveis, além do PTFE recomendado, podem ser testados com esses conectores. Esta é uma maneira rápida e econômica de testar tubos e conectores sem sacrificar células de fluxo de vidro mais caras. Em contraste, os conjuntos de nanoportas são fixados permanentemente, suportam pressões de até 1.000 psi e, em nossas mãos, seu uso é restrito a tubos PEEK de diferentes diâmetros. Isso não é uma desvantagem, pois a tubulação PEEK é preferencialmente usada. Uma única célula de fluxo de vidro com conjuntos permanentes anexados pode ser reutilizada por mais de 1 ano com uso cuidadoso.