Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Die Fähigkeit, Protein-DNA-Interaktionen auf Einzelmolekülebene und in Echtzeit zu visualisieren, hat einen signifikanten Einblick in die Genomstabilität geliefert ^1,2. Zusätzlich zur Arbeit mit einzelnen DNA-Molekülen bietet die Möglichkeit, Transaktionen zwischen einzelnen Molekülen in der Nähe anzuzeigen, zusätzliche Einblicke ^3,4,5. Die Manipulation zusätzlicher DNA-Moleküle erfordert sowohl zusätzliche optische Fallen als auch hochwertige, mehrkanalige, mikrofluidische Flusszellen⁶.

Es gibt mehrere Methoden, um mehr als eine optische Falle zu erzeugen. Dazu gehören Galvanometer-Scanning-Spiegel, akustische optische Modulatoren und diffraktive Optiken, die holographische optische Pinzetten 4,7,8,9 erzeugen. Oft erzeugen scannende Spiegel und akustische optische Modulatoren Fallen, die Timesharing ermöglichen. In dem hier beschriebenen Aufbau wird der Strahl eines einzelnen Nd:YAG-Lasers auf Polarisation aufgeteilt, und dann steuern Galvanometer-Laserscanning-Spiegel die Position der sogenannten mobilen Falle (Abbildung 1)⁴. Um die Positionierung von Spiegeln und Filtern zu erleichtern, um den Einfangstrahl auf die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs zu lenken, wird ein HeNe-Laser verwendet. Dies erleichtert die Gesamtausrichtung, da der HeNe-Strahl mit bloßem Auge sichtbar ist, Infrarotstrahlen hingegen nicht. Der HeNe-Strahl ist auch sicherer zu arbeiten, wodurch die Positionierung von Spiegeln und anderen Komponenten weniger belastend wird. Zunächst ist der Strahlengang für diesen Laser vom 1064-nm-Strahl getrennt, wird aber in denselben Strahlengang und dann in das Mikroskopobjektiv eingeführt. Sobald die physikalische Ausrichtung erreicht ist, wird der 1064-nm-Strahl auf dem HeNe-Strahl positioniert, was durch die Verwendung eines Infrarot-Viewers und verschiedener Strahlbildgebungswerkzeuge zur Visualisierung der Strahlposition und -qualität erleichtert wird. Dann wird der Strahlexpander eingeführt und der resultierende erweiterte Infrarotstrahl wird auf die hintere Öffnung des Objektivs ausgerichtet. Schließlich wird das Objektiv entfernt und die Leistung in jedem polarisierten Strahl wird gemessen und unter Verwendung von λ/2-Wellenplatten so eingestellt, dass sie gleich ist (Abbildung 1C). Leistungsmessungen werden auch durchgeführt, sobald das Objektiv zurückgegeben wird, und in der Regel gibt es einen Leistungsverlust von 53%. Es ist jedoch genügend Energie vorhanden, um stabile feste und bewegliche optische Fallen in der Brennebene zu bilden (Abbildung 1D).

Für die Abbildung von DNA-Transaktionen spielen mikrofluidische Flusszellen eine Schlüsselrolle, da sie kontrollierte Messungen auf Einzelmolekülebene mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen (Abbildung 2). Der Begriff Mikrofluidik bezieht sich auf die Fähigkeit, Flüssigkeiten in einem oder mehreren Kanälen mit Abmessungen von 5-500 μm^10,11 zu manipulieren. Der Begriff Strom bezieht sich auf die tatsächliche Flüssigkeit innerhalb eines Kanals und der Kanal bezieht sich auf den physikalischen Kanal, in dem sich ein oder mehrere Flüssigkeitsströme bewegen. Einkanal-Durchflusszellendesign hat einen gemeinsamen, physikalischen Kanal, in dem Reaktionen beobachtet werden und typischerweise nur ein Flüssigkeitsstrom vorhanden ist. Daher werden diese Designs als Single-Stream-Durchflusszellen bezeichnet. Im Gegensatz dazu sind Multi-Stream-Durchflusszellen als mikrofluidische Vorrichtung definiert, bei der zwei oder mehr Eintrittskanäle zu einem einzigen, gemeinsamen, physikalischen Kanal konvergieren (Abbildung 2A). Innerhalb des gemeinsamen Kanals fließen die aus den einzelnen Kanälen stammenden Flüssigkeitsströme parallel zueinander und bleiben getrennt, wobei aufgrund der Diffusion nur eine minimale Durchmischung zwischen ihnen auftritt (Abbildung 2B). In den meisten Versuchsaufbauten drückt eine einzige Pumpe Flüssigkeiten mit der gleichen Geschwindigkeit in jeden Kanal. Im Gegensatz dazu drücken bei der Grenzlenkung drei oder mehr unabhängig voneinander gesteuerte Pumpen Flüssigkeiten durch die Kanäle. Jede Pumpe arbeitet jedoch mit einer anderen Drehzahl, aber der Nettodurchfluss im gemeinsamen Kanal ist konstant¹². Dies ermöglicht den schnellen Austausch von Hauptkanalkomponenten durch einfache Änderung der Pumpendrehzahl.

Neben der laminaren Strömung ist ein weiterer kritischer Faktor das parabolische Geschwindigkeitsprofil innerhalb des laminaren Strömungsstroms. Die höchste Strömungsgeschwindigkeit tritt in der Mitte des Stroms auf, die langsamste in der Nähe der Oberflächen (Abbildung 2C)¹³. Dieses Profil muss berücksichtigt werden, um ein DNA-Molekül, das an eine im Strom gehaltene Perle gebunden ist, vollständig zu dehnen, um fluoreszierende DNA präzise zu visualisieren und genaue Einzelmolekülanalysen durchzuführen. Hier wird die DNA zur B-Form gestreckt und unter 0 pN Kraft an Ort und Stelle gehalten. Um dies zu erreichen, sollte die Fokussierung der optischen Fallenposition auf eine Position 10-20 μm von der unteren Deckglasoberfläche erfolgen (Abbildung 2D). Es muss darauf geachtet werden, dass das DNA-Molekül nicht über die B-Form hinaus gestreckt wird, da dies Enzymreaktionen hemmen kann. Unter typischen Pufferbedingungen ist 1 μm = 3.000 bp DNA¹⁴. Darüber hinaus wird der DNA-Komplex durch das Einfangen von 10-20 μm vom Deckglas weit von der Oberfläche entfernt, wodurch Oberflächeninteraktionen minimiert werden.

Viele Methoden wurden verwendet, um mikrofluidische Gerätekanäle zu erzeugen, und diese können im Labor durchgeführt werden oder Durchflusszellen können aus kommerziellen Quellen gekauft werden 6,15,16,17. Die optimalen Materialien, die für die Konstruktion der Durchflusszellen verwendet werden, müssen mechanisch steif, optisch transparent mit geringer Fluoreszenz und undurchlässig für organische Lösungsmittel sein⁶. Häufig wird Borosilikat-Floatglas oder Quarzglas verwendet, um eine stabile Strömungsumgebung für eine längere Zeit bereitzustellen, die für optisches Einfangen, Visualisierung und Krafterkennung geeignet ist. Diese Materialien ermöglichen auch die Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln (z. B. spektrophotometrisches Methanol), um die Oberflächenbenetzung und Entfernung von Luftblasen zu vereinfachen, und Denaturierungsmitteln (z. B. 6M Guanidiniumhydrochlorid) oder Reinigungsmitteln zur Reinigung der Durchflusszelle. Schließlich variieren die Methoden zum Einbringen von Flüssigkeiten in Durchflusszellen von komplexen Vakuumpumpensystemen bis hin zu einzelnen Spritzenpumpen 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bei dem hier beschriebenen Ansatz wird eine Spritzenpumpe verwendet, die bis zu 10 Spritzen aufnehmen kann (Abbildung 3A). Dies bietet Flexibilität für den Einsatz von einkanaligen Durchflusszellen oder Durchflusszellen mit mehreren Einlasskanälen. Hier wird eine dreikanalige Durchflusszelle verwendet, die mit Spritzen verbunden ist, die an der Spritzenpumpe mit Polyetherether-Keton-Schläuchen (PEEK) befestigt sind (Abbildung 3A-C). Der Durchfluss von Flüssigkeiten wird durch Vierwegeschaltventile gesteuert und dient somit dazu, das Einbringen von Blasen in die Durchflusszelle zu minimieren (Bild 3A,D). Darüber hinaus werden gasdichte Hamilton-Spritzen mit steifen Glaswänden und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben empfohlen, da sie eine außergewöhnlich gleichmäßige Kolbenbewegung bieten, die für einen reibungslosen Fluss unerlässlich ist^14,27.

In dem beschriebenen Versuchssystem wurden Flusszellen mit zwei bis fünf Einlasskanälen eingesetzt. Die Anzahl der Einlasskanäle wird durch das durchgeführte Experiment bestimmt. Für die Untersuchung von RecBCD und Hop2-Mnd1 waren zwei Stromkanäle ausreichend^14,28. Für die Helikase wurde das Enzym an das freie Ende der DNA gebunden und in einen Strom mit Magnesium und ATP übersetzt, um die Translokation und den Abbau einzuleiten. Für Hop2-Mnd1 wurde optisch eingeschlossene DNA in den angrenzenden Flüssigkeitsstrom übersetzt, der Proteine und Puffer ± zweiwertigen Metallionen enthält. Die Verwendung von Dreikanal-Flusszellen ermöglicht es, DNA in Strom 1 einzufangen, die DNA in Strom 2 zu übersetzen, um eine Proteinbindung zu ermöglichen, und dann in Strom 3, wo ATP vorhanden ist, um beispielsweise Reaktionen auszulösen. Eine Variation des oben Gesagten besteht darin, fluoreszierendes Protein in Kanal 2 zu verwenden, was dazu führt, dass der Flüssigkeitsstrom vollständig weiß ist und die Visualisierung der DNA ausschließt. Wenn dieses Molekül in Strom 3 übersetzt wird, sind nun sowohl Proteine als auch DNA sichtbar, wenn Reaktionen ausgelöst werden.

Die Verwendung von Vierwege-Schaltventilen zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses ist eine kritische Komponente des Systems, um Blasen in den Durchflusszellen zu eliminieren. Blasen sind schädlich für eine stabile Flüssigkeitsströmung, da sie sich auf unvorhersehbare Weise zusammenziehen und ausdehnen, was zu schnellen Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit und der Einführung von Turbulenzen führt. Wenn die Ventile zwischen Spritzen und Einlassschlauch positioniert sind, wird der Durchflusspfad durch Umschalten der Ventilposition beim Spritzenwechsel getrennt. Wenn die neue Spritze eingesetzt wird, kann der Kolben manuell gedrückt werden, so dass >6 μL (das Totvolumen des Ventils) ausgestoßen werden und Blasen fast vollständig eliminiert werden.

Die Befestigung von Steckverbindern an Durchflusszellen ist häufig der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Verwendung von Durchflusszellen. Wir beschreiben die Verwendung von zwei Arten von Steckverbindern: abnehmbare sogenannte Press-Fit-Steckverbinder und permanente (Nanoport-Baugruppen). Die abnehmbaren Verbinder lassen sich einfach auf eine Durchflusszelle kleben und mit diesen Steckverbindern können neben dem empfohlenen PTFE auch verschiedene Arten von flexiblen Schläuchen getestet werden. Dies ist eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Schläuche und Steckverbinder zu testen, ohne auf teurere Glasdurchflusszellen verzichten zu müssen. Im Gegensatz dazu sind Nanoport-Baugruppen dauerhaft angebracht, halten Drücken bis zu 1.000 psi stand und in unseren Händen ist ihre Verwendung auf PEEK-Schläuche unterschiedlicher Durchmesser beschränkt. Dies ist kein Nachteil, da vorzugsweise PEEK-Schläuche verwendet werden. Eine einzelne Glasdurchflusszelle mit festen Baugruppen kann bei sorgfältigem Gebrauch länger als 1 Jahr wiederverwendet werden.