Koherent Anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) Ansökan om avbildningsmyelinering i hjärnskivor
Summary
Att visualisera myelinisering är ett viktigt mål för många forskare som studerar nervsystemet. CARS är en teknik som är kompatibel med immunofluorescens som naturligt kan avbilda lipider i vävnad som hjärnan som belyser specialiserade strukturer som myelin.
Abstract
Koherent anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) är en teknik som klassiskt används av kemister och fysiker för att producera en sammanhängande signal om signaturvibrationer av molekyler. Dessa vibrationssignaturer är emellertid också karakteristiska för molekyler i anatomisk vävnad som hjärnan, vilket gör den alltmer användbar och tillämplig för neurovetenskapliga applikationer. Till exempel kan CARS mäta lipider genom specifikt spännande kemiska bindningar inom dessa molekyler, vilket möjliggör kvantifiering av olika aspekter av vävnad, såsom myelin som är involverat i neurotransmission. Dessutom, jämfört med andra tekniker som vanligtvis används för att kvantifiera myelin, kan CARS också ställas in för att vara kompatibelt med immunofluorescerande tekniker, vilket möjliggör sammärkning med andra markörer såsom natriumkanaler eller andra komponenter för synaptisk överföring. Myeliniseringsförändringar är en i sig viktig mekanism vid demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros eller andra neurologiska tillstånd som bräckligt X-syndrom eller autismspektrumstörningar är ett framväxande forskningsområde. Sammanfattningsvis kan CARS användas på innovativa sätt för att svara på pressande frågor inom neurovetenskap och ge bevis för underliggande mekanismer relaterade till många olika neurologiska tillstånd.
Introduction
Åtgärdspotentialer är den grundläggande enheten för information i hjärnan, och handlingspotentialutbredning genom axoner utgör en pelare i informationsbehandling 1,2,3. Neuroner tar vanligtvis emot afferenta ingångar från flera andra neuroner och integrerar dessa ingångar inom ett givet smalt tidsfönster 4,5. Därför har verkningsmekanismerna potentiell förökning i axoner fått en betydande uppmärksamhet från utredare.
Vid förökning genom en axon regenereras en åtgärdspotential upprepade gånger längs axonen för att säkerställa tillförlitlig förökning6. I de flesta neuroner av käkade ryggradsdjur (gnathostomer) är axoner omgivna av en mantel av myelin, som är en lipidrik substans som produceras av närliggande oligodendrocyter eller Schwann-celler, som är typer av gliaceller (granskad i 7,8). Denna myelinmantel isolerar axonen elektriskt, minskar dess kapacitans och möjliggör utbredning av åtgärdspotential effektivt, snabbt och med lägre energiförbrukning. Myelin täcker inte axonen enhetligt, men den mantlar axonen i segment som har korta luckor mellan dem, kallade Ranviers noder (granskad i 9,10). Både myelineringstjocklek, som styr nivån på elektrisk isolering av en axon, och avståndet mellan Ranviers noder, som styr frekvensen med vilken åtgärdspotentialer regenereras längs en axon, påverkar hastigheten på åtgärdspotentialutbredningen (granskad i11).
Det finns en stor mängd litteratur som tyder på att myeliniseringstjockleken påverkar hastigheten på åtgärdspotentialutbredningen i axoner12,13,14. Dessutom kan förändringar i axonmyelinisering resultera i ett antal CNS-underskott 15,16,17,18,19,20,21. Det är därför inte förvånande att fokus för många forskningsinsatser involverar mätning och karakterisering av axonmyelinisering. Mätningar av myelintjocklek har oftast gjorts med elektronmikroskopi, en teknik som kräver en betydande mängd vävnadsberedning och är utmanande att använda i kombination med immunhistokemi. Det finns dock också en snabbare och enklare teknik för att mäta axonmyelinisering som bygger på Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). En CARS-laser kan ställas in på olika frekvenser och när den är inställd på frekvenser som är lämpliga för att excitera lipider kan myelin avbildas utan behov av ytterligare etiketter22. Lipidavbildningen kan kombineras med standardimmunhistokemi så att lipider kan avbildas tillsammans med flera fluorescerande kanaler23. Avbildningsmyelinering med CARS är betydligt snabbare än elektronmikroskopi och har en upplösning som, om än lägre än EM, är tillräcklig för att upptäcka även små skillnader i myelinering i samma typ av axoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En växande mängd litteratur betonar myelins roll i hjärnans funktion 13,16,21,28. Dessutom vet vi att myelineringstjocklek och myeliniseringsmönster kan förändras vid flera neurologiska tillstånd som multipel skleros (granskad i29), åldrande (granskad i 30), autism20,31 och många andra.…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöds av NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) och NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 och FRAXA (McCullagh). CARS-avbildningen utfördes i Advanced Light Microscopy Core-delen av NeuroTechnology Center vid University of Colorado Anschutz Medical Campus som delvis stöds av NIH P30 NS048154 och NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
Referencias
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
