Coherent Anti-Stokes Raman spektroskopi (CARS) Søknad om bildebehandling av myelinasjon i hjerneskiver
Summary
Visualisering av myelinisering er et viktig mål for mange forskere som studerer nervesystemet. CARS er en teknikk som er kompatibel med immunfluorescens som naturlig kan avbilde lipider i vev som hjernen som belyser spesialiserte strukturer som myelin.
Abstract
Koherent anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) er en teknikk som klassisk brukes av kjemikere og fysikere for å produsere et sammenhengende signal om signaturvibrasjoner av molekyler. Imidlertid er disse vibrasjonssignaturene også karakteristiske for molekyler i anatomisk vev som hjernen, noe som gjør den stadig mer nyttig og anvendelig for nevrovitenskapsapplikasjoner. For eksempel kan CARS måle lipider ved spesielt spennende kjemiske bindinger i disse molekylene, noe som muliggjør kvantifisering av forskjellige aspekter av vev, for eksempel myelin involvert i nevrotransmisjon. I tillegg, sammenlignet med andre teknikker som vanligvis brukes til å kvantifisere myelin, kan CARS også settes opp for å være kompatible med immunfluorescerende teknikker, noe som muliggjør sammerking med andre markører som natriumkanaler eller andre komponenter i synaptisk overføring. Myeliniseringsendringer er en iboende viktig mekanisme i demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose eller andre nevrologiske tilstander som Fragilt X-syndrom eller autismespekterforstyrrelser er et fremvoksende forskningsområde. Avslutningsvis kan CARS brukes på innovative måter for å svare på presserende spørsmål i nevrovitenskap og gi bevis for underliggende mekanismer relatert til mange forskjellige nevrologiske forhold.
Introduction
Handlingspotensialer er den grunnleggende informasjonsenheten i hjernen, og handlingspotensialutbredelse gjennom aksoner danner en søyle i informasjonsbehandling 1,2,3. Nevroner mottar vanligvis afferente innganger fra flere andre nevroner og integrerer disse inngangene innenfor et gitt smalt tidsvindu 4,5. Derfor har virkningsmekanismene potensiell forplantning i aksoner fått betydelig oppmerksomhet fra etterforskere.
Ved forplantning gjennom et akson regenereres et handlingspotensial gjentatte ganger langs aksonet for å sikre pålitelig forplantning6. I de fleste nevroner av kjeve vertebrater (gnathostomer) er axoner omgitt av en skjede av myelin, som er en lipidrik substans produsert av nærliggende oligodendrocytter eller Schwann-celler, som er typer glialceller (gjennomgått i 7,8). Denne myelinskjeden isolerer aksonet elektrisk, reduserer kapasitansen og tillater handlingspotensialutbredelse effektivt, raskt og med lavere energiforbruk. Myelin dekker ikke aksonet jevnt, men det kapper aksonet i segmenter som har korte hull mellom dem, kalt nodene til Ranvier (gjennomgått i 9,10). Både myeliniseringstykkelsen, som styrer nivået av elektrisk isolasjon av et akson, og avstanden mellom nodene til Ranvier, som styrer frekvensen som handlingspotensialer regenereres langs et akson, påvirker hastigheten på handlingspotensialutbredelsen (gjennomgått i11).
Det er en stor mengde litteratur som tyder på at myeliniseringstykkelsen påvirker hastigheten på virkningspotensialutbredelsen i aksoner12,13,14. Videre kan endringer i aksonmyelinisering resultere i en rekke CNS-underskudd 15,16,17,18,19,20,21. Det er derfor ikke overraskende at fokus for mange forskningsinnsatser innebærer måling og karakterisering av aksonmyelinisering. Målinger av myelintykkelse har oftest blitt gjort med elektronmikroskopi, en teknikk som krever en betydelig mengde vevspreparering og er utfordrende å bruke i kombinasjon med immunhistokjemi. Imidlertid er det også en raskere og enklere teknikk for å måle aksonmyelinisering som er basert på Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). En CARS-laser kan stilles inn på forskjellige frekvenser, og når den er innstilt på frekvenser som er egnet til å opphisse lipider, kan myelin avbildes uten behov for ytterligere etiketter22. Lipidavbildningen kan kombineres med standard immunhistokjemi slik at lipider kan avbildes sammen med flere fluorescerende kanaler23. Imaging myelinisering med CARS er betydelig raskere enn elektronmikroskopi og har en oppløsning som er, om enn lavere enn EM, tilstrekkelig til å oppdage selv små forskjeller i myelinisering i samme type axoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En voksende litteratur understreker myelins rolle i hjernefunksjonen 13,16,21,28. Videre vet vi at myeliniseringstykkelse og myeliniseringsmønster kan endres i flere nevrologiske tilstander som multippel sklerose (gjennomgått i29), aldring (gjennomgått i 30), autisme20,31 og mange andre.</sup…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttes av NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) og NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 og FRAXA (McCullagh). CARS-avbildningen ble utført i Advanced Light Microscopy Core-delen av NeuroTechnology Center ved University of Colorado Anschutz Medical Campus, delvis støttet av NIH P30 NS048154 og NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
Referencias
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
