En guide för att undersöka intramuskulär fettbildning och dess cellulära ursprung i skelettmuskulaturen

Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Florida. 1. Genetisk härstamningsspårning av FAP OBS: Om genetisk härstamningsspårning av FAPs inte önskas kan steg 1 hoppas över. För att utföra härstamningsspårning av FAP, skaffa nödvändiga musalleler.OBS: Flera tamoxifeninducerbara Cre-linjer, under kontroll av Pdgfrα-promotorn , har genererats för att framgångsrikt rikta in sig på FAP, inklusive från Hogan29, Rando27 och Bergles32 laboratorier. Som genetisk reporter av Cre-aktivitet finns många Rosa26-reporteralleler tillgängliga som Rosa26EYFP33. Även om det föreslås för varje laboratorium att avgöra vilken Cre-Reporter-kombination som är mest effektiv, genom att korsa PdgfrαCreERT2-möss (29 och Jax # 032770) till Rosa26EYFP (33 och Jax # 006148) reporter, den resulterande PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-mösskan användas för att effektivt och specifikt markera FAPs20. För att spåra ödet för mogna FAPs rekommenderas att vänta tills möss har nått minst ~ 10 veckors ålder innan de administrerar tamoxifen. Härstamningsspårningsexperiment kan utföras på både män och kvinnor. Administrering av tamoxifen genom oralt födosök Förbered 40 mg / ml tamoxifen i majsolja och virvel väl för att blanda 1 dag före sondering. Inkubera O/N vid 37 °C i en roterande hybridiseringsugn.VARNING: Tamoxifen är cancerframkallande och bör hanteras försiktigt. Använd alltid handskar vid hantering och använd en mask när du väger den som ett pulver, eftersom det finns risk för inandning. Rengör området enligt protokoll och fäst en gavaging nål på en 1 ml spruta. Dra in 200 μl tamoxifen i sprutan. Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP-möss (10 veckor gamla; båda könen används) genom att placera dem på en plan yta och ta ett fast grepp om svansens botten. Använd en fri hand för att ta tag i mitten av musen med tummen och pekfingret och skjut sedan försiktigt och med lätt tryck greppet tills det bara är förbi axlarna. Nyp tillbaka huden med tummen och pekfingret, ta upp musen och vänd handen så att musen är vänd mot användaren och stoppa svansen mellan det rosa och ringfingret på handen som håller musen. Se nu till att musen är väl immobiliserad och inte kan röra huvudet eller armarna. Sätt in gavagenålen i munnen och använd den för att luta musens huvud något tillbaka; detta gör att matstrupen kan vara bättre tillgänglig. Sätt försiktigt och långsamt in nålen i matstrupen. Tvinga inte nålen om något motstånd är uppfyllt; nålen ska glida ner lätt. Injicera långsamt tamoxifen. Övervaka mössen i 15-20 minuter för att säkerställa att inga problem uppstår under sondering.OBS: Administrering av tamoxifen på 2 på varandra följande dagar resulterar vanligtvis i ~ 75% -85% rekombinationseffektivitet av FAPs utan att orsaka några negativa effekter. Det rekommenderas att användaren väntar i 1-2 veckor innan han inducerar skada, vilket gör att det återstående tamoxifenet kan tas bort från systemet och eventuellt återstående protein vändas. 2. Skada på tibialis främre (TA) muskel OBS: För att studera intramuskulärt fett rekommenderas det att använda en glycerolbaserad skademodell (50% glycerol i steril saltlösning), vilket resulterar i massiv intramuskulär fettbildning 34,35,36,37. Förbered bedövningsmaskinen genom att tillsätta isofluran och se till att rören till både muskammaren och noskonen är öppna. Rengör kammaren och arbetsområdet med antingen 70% etanol eller peroxidlösning (beroende på protokoll). Ställ in syreflödet på 2,5 l/min och isoflurankoncentrationen på 2,5 %. Placera en mus i anestesikammaren och vänta ~ 5 min tills den sövs. Placera musen i rygg på en ren värmedyna och sätt in näsan i noskonen. Applicera försiktigt vet oftalmisk salva på ögonen med en bomullsspetsad applikator för att förhindra torrhet under anestesi. Övervaka kontinuerligt anestesi och utför en tånypning på musen före skadan för att säkerställa att musen är helt sövd. Rengör benet som ska injiceras med en ny alkoholservett för att desinficera. Dra upp 30-50 μl 50% glycerol (beroende på mössens storlek) i insulinsprutan. Borsta försiktigt upp håret på skenbenet för att exponera platsen för TA.OBS: Det är lättare att flytta håret och uppnå bättre visualisering när det fortfarande är vått från alkoholservetten. Efter att ha lokaliserat TA (precis i sidled till skenbenet, sticker det något ut genom huden och kan kännas med mild palpation), sätt in nålen i TA distalt, nära fotleden. Sätt in nålen helt i muskeln och injicera långsamt glycerol medan du gradvis drar tillbaka nålen, vilket hjälper till att skada det mesta av muskeln.OBS: Det är bäst att sätta in nålen parallellt med benet, med bara en något förhöjd vinkel. En bra skada orsakar vanligtvis dorsiflexion eftersom TA drar ihop sig efter att nålen har dragits tillbaka. Om musens tår sprids ut är det troligt att extensor digitorum longus (EDL) -muskeln injicerades. Placera tillbaka musen i buren och övervaka i ca 15-20 min för att säkerställa anestesiåterhämtning. Kasta nålen i en behållare för vassa föremål. Sätt aldrig tillbaka en nål.OBS: Analgesi efter glycerol injektion ska tillhandahållas som godkänts av institutional animal care and use committee. Adipocyter kan observeras så snart som 5 dagar efter skada (dpi). Med 7 dpi har alla adipocyter bildats, och med 21 dpi har de mognat fullt ut. 3. Vävnadsskörd Förbered 4% PFA i 1x PBS och lägg på is innan skörden påbörjas. Placera alla plattor (12- eller 24-brunnar) som används för muskelfixering på is och tillsätt 4% PFA till varje brunn, se till att varje brunn har 10-20 gånger mer volym PFA än vävnaden som fixeras. Mellan 7 och 21 dagar efter glycerolskada, avliva musen enligt institutionella riktlinjer (dvs. isofluranöverdos följt av cervikal dislokation). Börja skörda alla vävnader som ska användas för histologi eller RNA-isolering.OBS: Vävnader ska snäppfrysas eller placeras i PFA inom 10-15 minuter efter offrasättning (figur 2). Spraya liberalt alla delar av musen som ska skäras in med 70% etanol för att hålla håret borta från dissekeringsområdet och instrumenten. Använd sax för att klippa huden runt toppen av benet, nära bäckenet (figur 3A). Dra försiktigt benets hud från toppen ner till fotleden (figur 3B).OBS: TA är en droppformad muskel med en tydligt definierad distal sena som fäster vid den mediala kilformen och det första metatarsala benet. Det är lateralt mot skenbenet och sträcker sig upp till underknäet. Ta först bort det yttre bindvävsskiktet (epimysium) med en pincett med skarp spets innan du skördar TA (figur 3C). Använd ett dissekerande mikroskop för att visualisera epimysium bättre. Skjut pincetten under TA från muskelns botten, börja vid den distala senan och dra försiktigt uppåt mot knäet (figur 3D). Sluta i slutet av muskeln; tryck inte förbi motståndet som känns vid underknäet. Om det finns betydande motstånd innan du når det nedre knäet, stoppa och fortsätt att ta bort kvarvarande lager av bindväv.OBS: Det finns en annan distal sena precis i sidled till TA-senan som fäster vid EDL, som är en smal muskel i sidled till TA. Att vara noga med att bara skjuta pincetten under TA-senan förhindrar oavsiktlig skörd av EDL, men den kan också enkelt tas bort efter fixering. När TA har lyfts delvis från benet med pincetten, använd samma rörelse med en skalpell för att bryta anslutningen av TA till det nedre knäet (figur 3E). Skär senan vid fotleden med sax för att helt ta bort TA. Hantera endast muskeln vid senan för att undvika att skada fibrerna. Skär 1/3 av TA i slutet mittemot senan (figur 3F), lägg den i ett mikrocentrifugrör och snäppfrys genom att släppa den i flytande kväve (figur 3H). Sänk ner de andra 2/3 av vävnaden i en märkt brunn med 4% PFA för histologi (figur 3I). Var noga med att hålla reda på när den första och sista vävnaden placerades i fixativ. Placera på en shaker i 2-2,5 timmar vid 4 °C. Varaktigheten av fixeringen är beroende av vävnaden och dess storlek. Bestäm den varaktighet som krävs för att fixera vävnaderna. Fixering av TAs i 2-2,5 timmar vid 4 ° C bevarar vanligtvis adipocytmorfologi väl utan att orsaka överfixering av vävnaden.OBS: Om du planerar att använda TA för helmonterad immunofluorescerande färgning, hoppa över resten av detta protokoll tills du når avsnitt 7: “Helmonterad immunofluorescerande färgning”. Efter fixering, ta bort PFA från brunnarna, skölj vävnaderna med kall 1x PBS 2-3 gånger och tvätta sedan 2-3 gånger med kall 1x PBS i 5 min per tvätt. Ta bort PBS från brunnarna och tillsätt tillräckligt med 30% sackaros i 1x PBS så att vävnaden kan flyta. Placera den på shakern vid 4 °C över natten. Figur 3: Sammanfattning av vävnadsskörden (A) Huden skärs vid benets botten och (B) bakbensmusklerna exponeras. (C) När epimysium har tagits bort från TA används (D) pincett för att delvis separera muskeln och säkerställa att epimysium har tagits bort helt. (E) TA skärs från benet med en skalpell och avlägsnas efter skärning av senan. (G) Efter att ha skurit ta i en tredjedels och två tredjedelars bit, (H) är en tredjedel snäppfryst i flytande kväve för RT-qPCR-analys och (I) den andra två tredjedelen fixeras i 4% PFA för histologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 4. Inbäddning Förbered provformarna som ska användas för inbäddning genom att märka och fylla med tillräckligt med inbäddningsmedium för att helt sänka ner vävnaderna. Ta bort vävnader från brunnarna, torka av överflödig sackaros på en pappershandduk och flytta till de frysande medelfyllda provformarna.OBS: Det är bra att veta i vilken riktning formen med delas på kryostaten. På så sätt kan användaren orientera vävnaderna i formen på ett sätt som gör att intresseområdet är lättillgängligt. För TA skulle detta uppnås genom att sätta den tjockaste änden (mittemot senansidan) mot ytan som kommer att sektioneras. Detta gör att TA lätt kan sektioneras vid sin tjockaste del (mage) och möjliggör tvärsnittsskärning av muskelfibrerna. Förbered en isopenuppslamning genom att delvis sänka ner en behållare som innehåller isopentan i flytande kväve. Se till att det finns tillräckligt med flytande isopentan i behållaren för att sänka ner ungefär hälften av provformen som ska användas för att bädda in vävnaderna. Börja frysa formarna genom att försiktigt lägga dem i isopenanuppslamningen och se till att ungefär hälften av formen är nedsänkt. Se också till att formen fryser lika från alla fyra sidor. Ta formen ur isopanten precis innan hela formen är synligt frusen över från toppen. Hur lång tid det tar beror på vilka formar som används. Förvara de frysta formarna i en behållare med torris medan du fryser resten av blocken och förvara dem sedan vid -80 °C.OBS: Isopentan för frysning kan återanvändas. Sätt i en glasflaska men dra inte åt locket förrän isopentan når rumstemperatur (RT). Annars kan tryckförändringen krossa flaskan. 5. Sektionering Ställ in kryostaten på -22 till -24 °C, tillsätt formar som innehåller TAs i kryostaten och vänta i minst 30 minuter på temperaturacklimatisering. Under tiden märker du en serie positivt laddade mikroskopglas. Sätt i en krängningsplatta och rikta in den mot kryostaten så att det finns minimala hack i plattan där den kommer i kontakt med provblocket. Säkert på plats. Sätt i ett nytt kryostatblad i bladhållaren och säkra det på plats.VARNING: Bladet är vasst. Täck bladet när du manipulerar andra delar av kryostaten eller frysta formar. Ta bort det frusna blocket från formen. Lägg till ett enhetligt lager av inbäddningsmedium till kryostatchucken och placera blocket i mediet. Låt det sitta i 1-3 minuter tills inbäddningsmediet är helt fruset (ogenomskinligt vitt).OBS: För TAs bör det tjockaste området (magen) vara synligt när du är på chucken. Placera kryostatchucken med vävnadsblocket i kryostaten. Avtäck bladet och för kryostaten framåt tills den precis kommer i kontakt med bladet. Sektion genom blocket vid 25 μm sektioner tills vävnaden inte längre döljs av inbäddningsmediet.OBS: Justera kryostatens vinkel och / eller scenens position under sektionering så att sektionerna har en jämn tjocklek. Det kan vara bra att samla några sektioner för att säkerställa enhetlighet i sektionstjockleken. Det rekommenderas att användaren hittar rätt krängningsplattposition innan han eller hon går vidare till det intressanta området inom TA (magen), eftersom detta gör att användaren kan prova flera positioner på krängningsplattan tills sektionerna lossnar rakt utan att slösa bort vävnad. Ändra sektionstjockleken till 10-12 μm och samla sektionerna på märkta mikroskopglas. Seriell sektionering rekommenderas genom att samla intilliggande sektioner på 6-10 bilder (märkta 1-x), vilket möjliggör färgning för flera markörer. Om det behövs, använd en tunn borste för att lossa sektioner innan du samlar dem på bilden.OBS: Om sektionerna krullar, kontrollera att temperaturen håller sig stadigt inom intervallet -22 till -24 °C. Om det finns vertikala strimmor i sektioner kan detta bero på ett nick i krängningsplattan eller bladet; Detta kan åtgärdas genom att justera krängningshämmarens läge och/eller byta till ett nytt blad. Efter att ha samlat intilliggande sektioner av samma sektionsplan på varje bild, justera tjockleken tillbaka till 25 μm för att avancera 150-200 μm genom blocket, justera sedan tjockleken tillbaka till 10-12 μm och börja sektionera igen.OBS: Denna seriella sektionering gör det möjligt för användaren att visualisera, avbilda och kvantifiera på olika djup genom TA; tre till fyra serieavsnitt per bild räcker. Förvara objektglasen och vävnadsblocken vid -80 °C. 6. Immunofluorescerande (IF) färgning av vävnadssektioner OBS: Eftersom antikroppskoncentrationer kan variera mellan partier och tillverkare rekommenderas optimering genom att utvärdera flera olika koncentrationer av antikropparna på testglas innan färgning av de intressanta bilderna färgas. Tina/torka objektsglas antingen vid RT eller på en varm platta vid 37 °C i 10-20 min. Använd en hydrofob penna för att rita en linje vid kanten av bildens pappersyta, där den möter glaset. Lägg bilderna i en Coplin-burk och tvätta med 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x på en shaker i minst 5 minuter per tvätt för att rehydrera vävnadssektionerna.OBS: Vid denna tidpunkt är det viktigt att inte låta bilderna sitta utan att vara nedsänkta i PBST (upp till den hydrofoba linjen), annars torkar vävnadssektionerna ut. Placera bilderna på hyllan i en befuktningskammare och överlagra bilderna med 310-350 μl blockerande lösning (5% åsneserum och 0,3% Triton X-100 i 1x PBS) i 1-2 timmar vid RT.OBS: Inget extra permeabiliseringssteg behövs, eftersom blockeringslösningen innehåller 0,3% Triton X-100 vilket möjliggör tillräcklig permeabilisering av vävnadssektionerna. Vid användning av primära antikroppar härledda från möss (dvs. PAX7 och MYOD1 som anges nedan) rekommenderas att inkludera ett mus-mot-mus-blockeringssteg med Fab-fragment (1:50) i blockeringslösningen för blockeringssteget. Detta kommer att bidra till att minska bakgrunden på grund av ospecifik bindning av musens sekundära antikropp till andra antikroppar än den primära. Späd de primära antikropparna som ska användas i blockeringslösningen strax innan du fortsätter till nästa steg enligt följande: Primära antikroppar för adipocytfärgning och hel sektionsavbildning: Utspädd kanin-anti-Perilipin vid en utspädningsförhållande på 1:1000. Primära antikroppar för härstamningsspårning av adipocyter: Späd kyckling anti-GFP i förhållandet 1:1000 och kanin-anti-Perilipin vid 1:1000. Primära antikroppar för härstamningsspårning av FAPs: Späd kyckling anti-GFP i förhållandet 1: 1000 och get anti-PDGFRα vid 1:250. Primära antikroppar för myogena markörer: Späd mus anti-PAX7 i förhållandet 1:25 eller mus anti-MYOD1 vid 1:250 och kanin-anti-LAMININ vid 1:1000.OBS: Även om antikropparna som anges ovan framgångsrikt har utvärderats med detta protokoll, är det troligt att andra markörer och antikroppar för att märka FAPs, adipocyter och / eller andra celltyper också är kompatibla med detta protokoll. Det rekommenderas starkt vid användning av primära antikroppar för första gången att användaren inkluderar en negativ kontrollglas, där primära antikroppar utelämnas. Detta kommer att styra för antikropparnas specificitet. Alla andra steg i protokollet följs, inklusive tillsats av sekundära antikroppar, men blockeringslösningen används ensam i nästa steg istället för den primära antikroppen i blockeringslösningen. Dumpa blockeringslösningen från objektglasen och lägg över med 310–350 μl blockerande lösning med primära antikroppar och inkubera över natten vid 4 °C i befuktningskammaren. Nästa dag dumpar du blockeringslösningen/primära antikroppar från bilderna och lägger dem i en Coplin-burk. Skölj bilderna 2-3 gånger med PBST och tvätta 3-5x med PBST på en shaker i minst 5 minuter per tvätt. Under den sista tvätten, förbered de sekundära antikropparna eller eventuella direkta konjugat som ska användas i blockeringslösningen. Minimera den tid dessa antikroppar spenderar i ljuset för att undvika fotoblekning. Späd sekundära antikroppar/direkta konjugat: 488 nm åsna anti-kyckling (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller anti-mus (1:1000), 568 nm åsna anti-get (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller falloidin (myofibrer; 1:100), DAPI-fläck (kärnor; 1:500). Överlägg objektglasen med 310-350 μL av blockeringslösningen med sekundära antikroppar och/eller direkta konjugat i befuktningskammaren. Inkubera vid RT i 1-2 timmar. Skydda prover från ljus från och med nu. Dumpa blockeringslösningen/sekundära antikroppar och lägg dem i en Coplin-burk. Skölj med PBST en gång och tvätta 3-5x med PBST på en shaker i minst 5 min per tvätt. Håll Coplin-burken täckt för att förhindra ljusexponering. Torka bilderna så bra som möjligt genom att knacka på kanterna och torka av ryggen mot en pappershandduk, men låt inte vävnadssektionerna torka ut. Tillsätt tre eller fyra droppar vattenhaltigt monteringsmedium till den övre horisontella kanten av bilden och lägg försiktigt till ett täckglas. Tryck inte ner eller rör dig om luftbubblor bildas under täckglaset. varje tryck eller rörelse kan snedvrida den bräckliga cellulära arkitekturen hos adipocyter. Låt monteringsmediet stelna i mörker över natten före avbildning. 7. Helmonterad immunofluorescerande färgning Efter ~ 1 timmars fixering (se steg 3.14), använd pincett med skarp spets för att skala bort myofibrer från den fasta TA. Placera de separerade fibrerna i en 24-brunnsplatta och tvätta 3x i 3 minuter vardera med PBST. För alla efterföljande inkubationer, se till att tillsätta locket för att förhindra avdunstning. Inkubera i 1 h i 1% Triton X-100 i 1x PBS vid RT (200-300 μL) på en shaker för att möjliggöra bättre penetration av antikroppar. Efter sköljning några gånger med PBST, täck över med blockerande lösning (200-300 μL) och blockera på en mutter eller shaker över natten vid 4 °C. Späd de primära antikropparna vid önskad koncentration (fördubbling av koncentrationen tenderar att vara en bra utgångspunkt) i blockeringslösningen. Inkubera proverna (200–300 μl) på en nutator eller shaker över natten vid 4 °C. Tvätta proverna noggrant med PBST hela dagen med frekventa byten vid RT på shakern, ca 4-6x i 30-60 min varje tvätt. Späd de sekundära antikropparna i blockeringslösningen vid önskad koncentration (1:500 tenderar att fungera bra) plus kärnfärgning och inkubera proverna (200-300 μl) på en mutter eller shaker över natten vid 4 °C. Tvätta proverna noggrant med PBST under hela dagen med frekventa byten vid RT på shakern, cirka 4-6 gånger i 30-60 minuter varje tvätt eller tvätt över natten vid 4 °C. För montering, torka försiktigt bort överflödig PBST och placera sedan fibrerna i en eller två droppar monteringsmedium på en glasskiva (figur 4A). För att höja täckglaset (18 mm x 18 mm), lägg till små lerfötter; detta förhindrar att fibrerna kläms och säkrar täckglaset till bilden. Modelleringsföreningar fungerar bra för detta. När täckglaset är säkrat, lägg till mer medium i kanten tills området under täckglaset är fullt.OBS: Istället för att använda ett monteringsmedium som innehåller anti-blekningsmedel kan vävnaden också flyttas genom en stigande serie glycerol (30% till 80% glycerol i PBS). Vänta i 1-2 dagar före avbildning för att möjliggöra härdning av monteringsmediet. 8. Avbildning av intramuskulärt fett Slå på mikroskopet och starta bildprogramvaran. Säkra bilden på scenen.OBS: För avbildning av adipocyter i muskelsektioner är ett 5x eller 10x mål i kombination med widefieldmikroskopi ofta tillräckligt. För visualisering av WM-IF krävs ett konfokalmikroskop. Använd valfri kanal för att identifiera det område som ska avbildas. I bildprogramvaran justerar du förstärknings- och exponeringstiden för varje kanal. Ta bilder av hela vävnaden i varje kanal (automatisk eller manuell enligt mikroskop och programvara som används) och slå samman enskilda plattor för att göra en komposit av hela TA-tvärsnittet.OBS: Det rekommenderas att ta bilder av två eller tre olika sektioner av samma TA på olika djup. Genom att kvantifiera adipocyterna i varje sektion och sedan rapportera medelvärdet undviks lokaliserade skillnader i mängden intramuskulärt fett på grund av exempelvis injektionsfel. 9. Kvantifiering av adipocyter Om det inte är installerat tidigare lägger du till plugin-programmet Cell Counter i ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). Importera bilderna till ImageJ som TIF-filer eller ursprungliga mikroskopfiler. Visa varje kanal i ImageJ som en separat TIF-fil.Om du använder LIF eller liknande mikroskopfiltyper, under Alternativ för import av bioformat , välj Hyperstack för Visa stack med och markera rutan för Delade kanaler. Klicka på OK för att öppna filen. Se också till att rutan Autoskalning är avmarkerad. Se till att bilderna för varje kanal är i 8-bitarsformat (och grå): Bild > Typ > 8-bitars. Slå samman DAPI -bilder (blå), GFP (grön), PERILIPIN (röd) och PHALLOIDIN (grå): Bild > färg > slå samman kanaler. Kontrollera att skalan (Analysera > Ange skala) är i mikron. Använd verktyget för frihandsval, skissera den skadade och oskadade delen av varje tvärsnitt, mät sedan (Analysera > mått) och registrera det skadade kontra oskadade området i ett kalkylblad.OBS: Skadad muskel kan identifieras som områden utan myofibrer eller områden befolkade av myofibrer som innehåller centralt belägna kärnor. Starta cellräknare: Plugins > CellCounter > initiera. Välj en räknartyp och räkna sedan varje adipocyt. Registrera det totala antalet adipocyter i ett kalkylblad och beräkna sedan antalet adipocyter per 1 mm2 av det skadade området. 10. Adipogen genuttrycksanalys med RT-qPCR RNA-isolering Innan du börjar, förvärm RNase-fritt vatten till 45 ° C och förbered färskt 70% EtOH (350 μL per prov). Tillsätt 1 000 μl guanidiumtiocyanat till varje rör som innehåller provet (se steg 3.12). Det är viktigt att pärlvispgodkända rör används.VARNING: Guanidiumtiocyanat är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och hantera i en dragskåp. Lägg till tre medelstora pärlor eller en stor och en liten pärla till varje rör. Homogenisera vävnaden vid 50 Hz i 2-4 min med en pärlvispare. Beroende på vävnadstyp och provstorlek kan det ta upp till 10 minuter. Tillsätt 200 μl kloroform.VARNING: Kloroform är giftigt. Använd personlig skyddsutrustning och hantera i en dragskåp. Skaka proverna i 15 s. Inkubera i 2-3 min vid RT. Centrifugera i 15 min vid 12 000 x g. Pipettera ut 350 μL av den klara supernatanten (övre lagret som innehåller RNA) och tillsätt till ett nytt mikrocentrifugrör innehållande 350 μL 70% etanol. Var försiktig så att du inte suger på de lägre protein- och /eller DNA-skikten Överför upp till 700 μl av blandningen till en minispinnkolonn placerad i ett 2 ml uppsamlingsrör. Fortsätt med RNA-isolering enligt tillverkarens instruktioner. Eluera med 30-50 μL RNase-fritt vatten, beroende på förväntat utbyte. Håll RNA på is och mät utbytet med en spektrofotometer. Förvara RNA vid -80 °COBS: Det är möjligt att utelämna DNase-behandlingssteget, eftersom det är tillräckligt att försiktigt ta av bara den övre 350 μL av RNA-skiktet för att förhindra DNA-kontaminering. Förutom RT-qPCR-analys kan det isolerade RNA också användas för RNA-sekvensering, i vilket fall ett DNase-behandlingssteg rekommenderas starkt. cDNA-syntes Använd upp till 1 μg RNA för att syntetisera cDNA med ett cDNA-synteskit, enligt tillverkarens instruktioner. När körningen är klar, tillsätt 80 μL RNase-fritt vatten. Förvara proverna vid -20 °C. RT-qPCR av adipocytselektiva gener. Använd ett 384-brunnsformat, tillsätt 1 μL primer (~ 1 μM slutlig koncentration) till botten av varje brunn. Förtorkningsprimrar resulterar i tätare tekniska replikat. Låt stå täckt tills grundfärgerna har avdunstat helt (plattan kan placeras på ett värmeblock inställt på 37 °C för att påskynda avdunstningen). Ställ in provreaktioner med fyra till åtta tekniska replikat enligt följande: 2,5 μL färgämnesbaserad RT-PCR-masterblandning, 2,1 μl RNasfritt vatten och 0,4 μL cDNA (~1 ng) med 5 μl total volym per brunn. Följande termiska cykelförhållanden användes: denatur vid 95 °C i 15 s och glödgning/sträckning vid 60 °C i 25 s i 40 cykler. Normalisera råa CT-värden (cykeltröskel) till hushållningsgener (dvs . Hprt – och Pde12) -nivåer genom att beräkna ΔΔCT enligt beskrivningen här38. Se20 för primersekvenser.OBS: Standardpraxis för RT-qPCR-analys bör följas, såsom användning av en minus omvänd transkriptionskontroll (-RT), PCR-reaktion och primervalidering.