FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü
Summary
Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP’lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC’ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP’ların ve MuSC’lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.
Abstract
Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP’ler), fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy boyunca farklılaşabilen iskelet kası yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin (MSC’ler) bir popülasyonudur. Kas kök hücreleri (MuSC’ler) ile birlikte FAP’lar, hücre dışı matrisi (ECM) aktif olarak korurken ve yeniden şekillendirirken, kas homeostazı, onarımı ve yenilenmesinde kritik bir rol oynar. Kronik hasar ve kas distrofileri gibi patolojik durumlarda, FAP’lar anormal aktivasyona uğrar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak fibroz ve kas içi yağ infiltrasyonuna yol açar. Bu nedenle, FAP’lar kas rejenerasyonunda, MuSC döngüsünü sürdürerek ve doku onarımını teşvik ederek veya iskelet kası dokusunun bütünlüğünü ve işlevini tehlikeye atan fibrotik skar oluşumuna ve ektopik yağ infiltrasyonlarına katkıda bulunarak ikili bir rol oynamaktadır. FAP ve MuSC’lerin uygun şekilde saflaştırılması, bu hücrelerin fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rolünü anlamak için bir ön koşuldur. Burada, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak FAP’ların ve MuSC’lerin yetişkin farelerin uzuv kaslarından eşzamanlı izolasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, mononüklee hücrelerin tüm ekstremite kaslarından ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından mekanik ve enzimatik ayrışmasını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. FAP’lar ve MuSC’ler daha sonra saf hücre popülasyonları elde etmek için yarı otomatik bir hücre sıralayıcısı kullanılarak izole edilir. Ek olarak, sessiz ve aktif FAP’ları ve MuSC’leri tek başına veya kokültür koşullarında kültürlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz.
Introduction
İskelet kası, yetişkin insan ağırlığının ~% 40’ını oluşturan vücuttaki en büyük dokudur ve duruşun korunmasından, hareket üretilmesinden, bazal enerji metabolizmasının düzenlenmesinden ve vücut ısısından sorumludur1. İskelet kası oldukça dinamik bir dokudur ve mekanik stres, metabolik değişiklikler ve günlük çevresel faktörler gibi çeşitli uyaranlara uyum sağlama konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Ek olarak, iskelet kası akut yaralanmaya yanıt olarak yenilenir ve morfolojisinin ve fonksiyonlarının tamamen restorasyonuna yol açar2. İskelet kası plastisitesi, esas olarak, miyofiber plazma zarı ile bazal lamina 2,3 arasında yer alan uydu hücreleri olarak da adlandırılan yerleşik kas kök hücrelerinin (MuSC’ler) popülasyonuna dayanır. Normal koşullar altında, MuSC’ler kas nişinde sessiz bir durumda bulunur, hücresel ciroyu telafi etmek ve kök hücre havuzunu yenilemek için sadece birkaç bölümvardır 4. Yaralanmaya yanıt olarak, MuSC’ler hücre döngüsüne girer, çoğalır ve ya yeni kas liflerinin oluşumuna katkıda bulunur ya da kendini yenileme sürecinde nişe geri döner 2,3. MuSC’lere ek olarak, iskelet kasının homeostatik bakımı ve yenilenmesi, fibro-adipojenik progenitörler (FAP’ler) olarak adlandırılan bir kas yerleşik hücre popülasyonunun desteğine dayanır5,6,7. FAP’lar kas bağ dokusuna gömülü mezenkimal stromal hücrelerdir ve fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy 5,8,9,10 boyunca farklılaşabilir. FAP’lar, kas kök hücre nişinde hücre dışı matriks proteinlerinin bir kaynağı oldukları için MuSC’ler için yapısal destek sağlar. FAP’lar ayrıca sitokinler ve miyogenez ve kas büyümesi için trofik destek sağlayan büyüme faktörleri salgılayarak iskelet kasının uzun süreli bakımını teşvik eder 6,11. Akut kas hasarı üzerine, FAP’lar yenilenen kasın yapısal bütünlüğünü destekleyen ve MuSC’lerin proliferasyonunu ve farklılaşmasını parakrin bir şekilde sürdürmek için elverişli bir ortam sağlayan geçici bir niş üretmek için hızla çoğalırlar5. Rejenerasyon ilerledikçe, FAP’lar apoptoz ile rejeneratif kastan temizlenir ve sayıları yavaş yavaş bazal seviye12’ye geri döner. Bununla birlikte, kronik kas hasarını destekleyen koşullarda, FAP’lar pro-apoptotik sinyallemeyi geçersiz kılar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak ektopik yağ infiltrasyonlarına ve fibrotik skar oluşumuna yol açan kas nişinde birikir12,13.
Çok etkili olmaları ve rejeneratif yetenekleri nedeniyle, FAP’lar ve MuSC’ler iskelet kası bozukluklarının tedavisinde rejeneratif tıpta prospektif hedefler olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, fonksiyonlarını ve terapötik potansiyellerini araştırmak için, FAP ve MuSC’lerin izolasyonu ve kültürü için etkili ve tekrarlanabilir protokoller oluşturmak önemlidir.
Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), boyut ve granülerlik gibi morfolojik özelliklere dayanarak farklı hücre popülasyonlarını tanımlayabilir ve hücre yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş antikorların kullanımına dayalı olarak hücreye özgü izolasyona izin verir. Yetişkin farelerde, MuSC’ler vasküler hücre adezyon molekülü 1’i (VCAM-1, CD106 olarak da bilinir) 14,15 ve α7-Integrin15’i ifade ederken, FAP’lar trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü α (PDGFRa) ve kök hücre antijeni 1’i (Sca1 veya Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 olarak ifade eder. . Burada açıklanan protokolde MuSC’ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olarak tanımlanırken, FAP’lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olarak tanımlanmıştır. Alternatif olarak, PDGFRαEGFP fareleri, FAP’ları CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları18,19 olarak izole etmek için kullanıldı. Ayrıca, PDGFRa-GFP + hücrelerinin floresan sinyali ile yüzey belirteci Sca1 tarafından tanımlanan hücreler arasındaki örtüşmeyi karşılaştırdık. Analizimiz, GFP eksprese eden tüm hücrelerin Sca1 için de pozitif olduğunu gösterdi, bu da her iki yaklaşımın da FAP’ların tanımlanması ve izolasyonu için kullanılabileceğini gösterdi. Son olarak, spesifik belirteç antikorları ile boyama, her hücre popülasyonunun saflığını doğruladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Saf yetişkin kök hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izolasyonu için etkili ve tekrarlanabilir protokollerin oluşturulması, işlevlerini anlamaya yönelik ilk ve en kritik adımdır. İzole FAP’lar ve MuSC’ler, kas hastalıkları için potansiyel bir tedavi olarak transplantasyon deneylerinde multiomik analiz yapmak için kullanılabilir veya kök hücre tedavisinde hastalık modellemesi için genetik olarak değiştirilebilir.
Burada açıklanan protokol, yetişkin farelerin a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MuSC izolasyonu konusundaki tavsiyeleri için Tom Cheung’a (Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIAMS-IRP tarafından NIH hibeleri AR041126 ve AR041164 aracılığıyla finanse edildi.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referencias
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Biología del desarrollo. 326 (1), 47-59 (2009).
