FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養
Summary
線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。
Abstract
線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができる骨格筋に常在する間葉系間質細胞(MSC)の集団です。FAPは、筋幹細胞(MuSC)とともに、細胞外マトリックス(ECM)を積極的に維持およびリモデリングしながら、筋肉の恒常性、修復、および再生に重要な役割を果たします。慢性的な損傷や筋ジストロフィーなどの病的状態では、FAPは異常な活性化を受け、コラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、線維症と筋肉内脂肪浸潤を引き起こします。したがって、FAPは、MuSC代謝回転を維持し、組織修復を促進するか、骨格筋組織の完全性と機能を損なう線維性瘢痕形成と異所性脂肪浸潤に寄与することにより、筋肉の再生に二重の役割を果たします。FAPおよびMuSCの適切な精製は、生理学的および病理学的状態におけるこれらの細胞の生物学的役割を理解するための前提条件です。ここでは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いて成体マウスの四肢筋からFAPとMuSCを同時に単離するための標準化された方法について説明します。プロトコルは、四肢筋全体および損傷した前脛骨筋(TA)からの単核細胞の機械的および酵素的解離を詳細に説明しています。その後、FAPおよびMuSCを半自動セルソーターを使用して単離し、純粋な細胞集団を取得します。さらに、静止および活性化されたFAPおよびMuSCを単独または共存培養条件で培養するための最適化された方法について説明します。
Introduction
骨格筋は体内で最大の組織であり、成人の体重の~40%を占め、姿勢の維持、運動の生成、基礎エネルギー代謝の調節、および体温1を担っています。骨格筋は非常に動的な組織であり、機械的ストレス、代謝変化、日常の環境要因など、さまざまな刺激に適応する優れた能力を持っています。さらに、骨格筋は急性損傷に応じて再生し、その形態と機能の完全な回復につながります2。骨格筋の可塑性は、主に筋線維原形質膜と基底層の間に位置するサテライト細胞とも呼ばれる常在筋幹細胞(MuSC)の集団に依存しています2,3。通常の条件下では、MuSCは静止状態で筋肉ニッチに存在し、細胞の代謝回転を補い、幹細胞プールを補充するための分裂はわずかです4。損傷に応答して、MuSCは細胞周期に入り、増殖し、新しい筋線維の形成に寄与するか、自己複製プロセスでニッチに戻ります2,3。MuSCに加えて、骨格筋の恒常性維持と再生は、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)と呼ばれる筋肉常在細胞の集団のサポートに依存しています5,6,7。FAPは、筋肉結合組織に埋め込まれた間葉系間質細胞であり、線維形成、脂肪原性、骨形成性、または軟骨原性の系統に沿って分化することができます5、8、9、10。FAPは、筋幹細胞ニッチにおける細胞外マトリックスタンパク質の供給源であるため、MuSCの構造的サポートを提供します。FAPはまた、筋形成と筋肉成長の栄養サポートを提供するサイトカインと成長因子を分泌することにより、骨格筋の長期維持を促進します6,11。急性筋損傷時には、FAPは急速に増殖して、再生する筋肉の構造的完全性をサポートし、パラクリン様式でMuSCの増殖および分化を維持するための好ましい環境を提供する一過性のニッチを生成します5。再生が進むにつれて、FAPはアポトーシスによって再生筋から除去され、その数は徐々に基底レベル12に戻ります。しかし、慢性的な筋肉損傷に有利な状態では、FAPはアポトーシス促進シグナル伝達を無効にして筋肉ニッチに蓄積し、そこでコラーゲン産生線維芽細胞と脂肪細胞に分化し、異所性脂肪浸潤と線維性瘢痕形成を引き起こします12,13。
FAPとMuSCは、その多能性と再生能力により、骨格筋疾患の治療のための再生医療の有望な標的として特定されています。したがって、それらの機能と治療の可能性を調べるためには、FAPとMuSCの分離と培養のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することが重要です。
蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、サイズや粒度などの形態学的特性に基づいてさまざまな細胞集団を同定でき、細胞表面マーカーに対する抗体の使用に基づいて細胞特異的な分離を可能にします。成体マウスでは、MuSCは血管細胞接着分子1(VCAM-1、CD106としても知られる)14,15およびα7-インテグリン15を発現し、FAPは血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)および幹細胞抗原1(Sca1またはLy6A/E)5,6,9,12,16,17を発現します。.ここで説明したプロトコルでは、MuSCはCD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-インテグリン+として同定され、FAPはCD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-インテグリン-として同定された。あるいは、PDGFRαEGFPマウスを使用して、FAPをCD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-インテグリン-イベントとして単離した18,19。さらに、PDGFRα-GFP+細胞の蛍光シグナルと表面マーカーSca1で同定された細胞の重なりを比較しました。私たちの分析は、すべてのGFP発現細胞がSca1に対しても陽性であることを示し、FAPの同定と単離にどちらのアプローチも使用できることを示しています。最後に、特異的マーカー抗体による染色により、各細胞集団の純度を確認した。
Protocol
Representative Results
Discussion
純粋な成体幹細胞集団の同定と単離のための効率的で再現性のあるプロトコルを確立することは、その機能を理解するための最初で最も重要なステップです。単離されたFAPおよびMuSCは、筋肉疾患の潜在的な治療法として移植実験におけるマルチオミクス解析を行うために使用することができ、または幹細胞治療における疾患モデリングのために遺伝子改変することができる。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MuSCの分離に関するアドバイスをくださったTom Cheung氏(香港科技大学)に感謝します。この作業は、NIAMS-IRPによって、NIH助成金AR041126およびAR041164を通じて資金提供されました。
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referencias
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