JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63872
, , , , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Imperial College London, 2Imperial College Centre for Synthetic Biology,Imperial College London, 3BioPharm Process Research,GlaxoSmithKline Research and Development, 4Department of Life Science,Imperial College London, 5School of Chemical & Bioprocess Engineering,University College Dublin

Summary

Il modello di glicosilazione di un anticorpo determina le sue prestazioni cliniche, quindi gli sforzi industriali e accademici per controllare la glicosilazione persistono. Poiché le tipiche campagne di glicoingegneria richiedono molto tempo e lavoro, la generazione di un protocollo rapido per caratterizzare l’impatto dei geni di glicosilazione utilizzando il silenziamento transitorio si rivelerebbe utile.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali ricombinanti legano specifici bersagli molecolari e, successivamente, inducono una risposta immunitaria o inibiscono il legame di altri ligandi. Tuttavia, la funzionalità e l’emivita degli anticorpi monoclonali possono essere ridotte dal tipo e dalla distribuzione della glicosilazione specifica dell’ospite. I tentativi di produrre anticorpi superiori hanno ispirato lo sviluppo di cellule produttrici geneticamente modificate che sintetizzano anticorpi glico-ottimizzati. La glicoingegneria richiede tipicamente la generazione di una linea cellulare knockout o knockin stabile utilizzando metodi come la proteina 9 associata a brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR). Gli anticorpi monoclonali prodotti da cellule ingegnerizzate vengono quindi caratterizzati utilizzando metodi spettrometrici di massa per determinare se è stato ottenuto il glicoprofilo desiderato. Questa strategia richiede molto tempo, è tecnicamente impegnativa e richiede specialisti. Pertanto, una strategia alternativa che utilizza protocolli semplificati per la glicoingegneria genetica e il rilevamento del glicano può aiutare gli sforzi verso anticorpi ottimali. In questo studio proof-of-concept, una cellula ovarica di criceto cinese produttrice di IgG è servita come ospite ideale per ottimizzare la glicoingegneria. L’RNA interferente breve mirato al gene Fut8 è stato consegnato alle cellule ovariche del criceto cinese e sono stati quantificati i conseguenti cambiamenti nell’espressione della proteina FUT8. I risultati indicano che il knockdown con questo metodo è stato efficiente, portando a una riduzione di circa il 60% di FUT8. L’analisi complementare del glicoprofilo anticorpale è stata eseguita utilizzando una tecnica rapida ma altamente sensibile: elettroforesi su gel capillare e rilevamento della fluorescenza indotta dal laser. Tutti gli esperimenti di knockdown hanno mostrato un aumento dei glicani afucosilati; tuttavia, il più grande cambiamento ottenuto in questo studio è stato ~ 20%. Questo protocollo semplifica gli sforzi di glicoingegneria sfruttando strumenti di progettazione in silico , reagenti di targeting genico sintetizzati commercialmente e saggi di quantificazione rapida che non richiedono una vasta esperienza precedente. Pertanto, le efficienze temporali offerte da questo protocollo possono aiutare le indagini su nuovi bersagli genici.

Introduction

La glicosilazione legata all’N è un processo enzimatico mediante il quale le parti oligosaccaridiche sono legate covalentemente ai residui di Asn. A differenza della sintesi proteica de novo, la sintesi del glicano è una reazione non modellata che si traduce in glicosilazione eterogenea delle proteine. La struttura, la composizione e la distribuzione dei glicani possono influenzare la conformazione e la funzione delle proteine. Infatti, la N-glicosilazione nella regione del frammento cristallizzabile (Fc) dell’immunoglobulina G (IgG) regola l’efficacia terapeutica, l’immunogenicità e l’emivita dell’anticorpo1. Pertanto, il paradigma quality by design (QbD) per lo sviluppo di prodotti proteici bioterapeutici ricombinanti identifica naturalmente la glicosilazione come attributo critico di qualità (CQA)2,3. Le cellule di mammifero sono spesso i sistemi di espressione preferiti in quanto producono intrinsecamente modelli di glicosilazione simili a quelli umani più da vicino di batteri, lieviti, insetti o cellule vegetali. Inoltre, le cellule dell’ovaio di criceto cinese (CHO) sono selezionate rispetto ad altre linee cellulari di mammiferi perché sono resistenti alle infezioni da virus umani, secernono prodotti ad alti titoli e possono essere coltivate in coltura in sospensione ad alte densità cellulari vitali4. Per quanto riguarda la formazione di glicani, le cellule di produzione murina non-CHO generano glicani immunogenici (galattosio legato all’α(1-3)[α(1-3)-Gal] e acido N-glicolilneuraminico [NeuGc]) che interferiscono con l’uso sicuro degli anticorpi monoclonali (mAbs)5. Questi benefici rendono le cellule CHO il principale sistema di espressione, responsabile della produzione di oltre l’80% di nuove bioterapie tra il 2014 e il 20186. Tuttavia, la glicosilazione indipendente dal modello è un meccanismo conservato che porta a bioterapie derivate da CHO con una serie di glicoforme.

Le strategie di sviluppo bioterapeutico mirano a controllare l’eterogeneità nelle cellule CHO mediante l’ingegneria genetica. Alcuni esempi di letteratura includono il knockdown delle sialidasi (Neu1, Neu3)7, il knockout 4,6-deidratasi (GMD)8 e la sovraespressione di glicosiltransferasi (GnTIII)9. I progressi nella glicoingegneria sono possibili grazie a una combinazione di risorse pubblicamente disponibili, come il genoma CHO10, e al continuo sviluppo di strumenti di ingegneria genetica, come le nucleasi effettori simili ad attivatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)-associate alla proteina 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Questi strumenti vengono tipicamente consegnati alle cellule CHO come DNA plasmidico o come complessi di ribonucleoproteine purificate (RNP). Al contrario, l’interferenza dell’RNA (RNAi) è una tecnologia di ingegneria genetica che, nella sua forma più semplice, richiede solo la consegna di oligonucleotidi di RNA interferente breve purificato (siRNA). Le proteine endogene elaborano il siRNA a doppio filamento in singoli filamenti e il complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RISC) della nucleasi forma un complesso con siRNA per scindere le sequenze di mRNA bersaglio 15,16,17. Il silenziamento genico tramite questo metodo è transitorio a causa dell’instabilità dell’RNA, ma l’indagine qui contenuta sfrutta questa funzione per aiutare uno screening rapido.

L’enzima modello selezionato per il presente studio, l’α1,6-fucosiltransferasi (FUT8), produce N-glicani con α-1,6 L-fucosi legata al nucleo (Fuc). Questa modifica è un determinante primario dell’attività della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), come evidenziato da studi di anticorpi commerciali. In assenza di fucosilazione del nucleo, Rituximab (anti-CD20 IgG1) aumenta l’ADCC di 50 volte e aumenta l’ADCC in Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) migliorando il legame fcgRIIIa 18,19. La fucosilazione del nucleo è, quindi, considerata una caratteristica indesiderabile di mAbs che giustifica gli sforzi per invertire questo fenotipo. Ci sono esempi di targeting del gene Fut8 di successo utilizzando siRNA con aumenti concomitanti di ADCC 20,21,22, anche se questi esempi forniscono siRNA Fut8 codificato sul DNA plasmidico. Tali esperimenti generano un silenziamento genico stabile poiché il DNA plasmidico funge da modello per la sintesi del siRNA. Ciò consente alle cellule di ricostituire le molecole di siRNA che vengono degradate dalle RNasi intracellulari e dalle fosfatasi. Al contrario, la somministrazione di siRNA sintetico esogeno consente solo il silenziamento genico transitorio poiché il siRNA non può essere reintegrato a causa della mancanza di un modello intracellulare. Pertanto, gli utenti dovrebbero considerare se i progetti sperimentali sono compatibili con siRNA derivati da plasmidi o sintetici. Ad esempio, gli studi incentrati sulla produzione di mAb di picco, in genere il sesto giorno della coltura23,24, possono optare per siRNA sintetici che possono essere consegnati alle cellule pochi giorni prima del picco di espressione. I vantaggi di un approccio transitorio che utilizza siRNA sintetici includono la capacità di esternalizzare la produzione e il fatto che più costrutti di siRNA possono essere generati in una frazione del tempo necessario per generare costrutti nei plasmidi. Inoltre, il siRNA sintetico è efficace, come evidenziato da esempi di silenziamento genico Fut8 che sono sufficienti per ridurre l’espressione della proteina FUT825 e produrre IgG afucosilati con aumento del legame FCgRIIIa e ADCC26.

Il successo di questo protocollo di glicoingegneria è stato determinato dal grado di glicosilazione Fc. La spettrometria di massa è normalmente il metodo di scelta per le analisi glicemiche; tuttavia, l’elettroforesi su gel capillare e la rilevazione a fluorescenza indotta da laser (CGE-LIF) sono perfettamente suscettibili di risolvere il glicoprofilo delle IgG purificate e hanno il vantaggio di una maggiore rapidità e semplicità. I protocolli di spettrometria di massa devono combinare i metodi cromatografici e di derivatizzazione appropriati, le sorgenti di ionizzazione e gli analizzatori di massa 27,28,29. Oltre a richiedere uno specialista qualificato, i protocolli di spettrometria di massa sono lunghi e la diversità dei metodi rende difficile confrontare i dati tra laboratori con configurazioni diverse. Nel contesto dei biofarmaci, CGE-LIF è un metodo sensibile in grado di fornire dettagli sufficienti di un glicoprofilo anticorpale ed è facilmente scalabile per metodi ad alto rendimento. Per miscele a bassa abbondanza e altamente complesse con glicoproteine scarsamente caratterizzate, i vantaggi della spettrometria di massa potrebbero rimanere. Tuttavia, l’analisi mAb ad alta risoluzione e ad alta sensibilità offerta dall’analisi N-glicano basata su CGE-LIF serve come logica per testare questo metodo. Inoltre, la preparazione e l’analisi del campione sono completate in poche ore30. Studi recenti hanno dimostrato che CGE-LIF può essere utilizzato per monitorare i glicani derivati dal plasma umano31, topo32 e CHO IgG33. Questi studi evidenziano l’uso di CGE-LIF per l’analisi di campioni ad alto rendimento e piccoli volumi di campioni.

Il metodo CGE-LIF presenta limitazioni che dovrebbero essere prese in considerazione. Il costo è una barriera significativa all’uso di questo e di altri dispositivi per l’analisi del glicano. Tuttavia, questi costi sono tipici del settore e si ritiene che CGE-LIF sia un’opzioneeconomicamente vantaggiosa 34. I laboratori con budget ridotti possono trovare più pratico noleggiare macchinari o esternalizzare l’analisi dei campioni. Un’altra considerazione di qualsiasi metodo analitico è la ripetibilità. La valutazione di CGE-LIF è stata condotta utilizzando 48 repliche dello stesso campione che sono state analizzate in giorni diversi. La deviazione standard relativa per capillare è stata determinata per la ripetibilità intrabatch e interbatch. Il confronto intrabatch delle repliche è risultato avere una deviazione standard relativa del 6,2%, indicando che le prestazioni capillari non sono uniformi. Inoltre, un confronto dei dati interbatch ha mostrato una deviazione standard relativa del 15,8%31, indicando che le prestazioni capillari cambiano nel tempo. Le carenze operative individuate potrebbero non applicarsi nel presente studio, che utilizza macchinari e reagenti proprietari diversi. Se gli utenti intendono sviluppare un protocollo interno, varrebbe la pena considerare lo studio di Ruhaak et al. 31, che ha valutato attentamente i reagenti per CGE-LIF. Pertanto, i reagenti per l’iniezione del campione (Hi-Di Formamide e DMSO), l’etichettatura del glicano (NaBH3CN o 2-picolina borano)31 e altri sono stati ottimizzati.

Questo studio presenta un protocollo di glicoingegneria efficiente in termini di tempo che combina la rapidità dell’RNAi diretto con l’analisi glicemica a valle. La metodologia è illustrata utilizzando il gene Fut8 come bersaglio per i motivi sopra descritti.

Protocol

1. Progettazione e ricostituzione del DsiRNA Usa Safari, Firefox o Microsoft Edge per accedere al sito Web IDT (https://eu.idtdna.com). Dalla home page, selezionare la scheda Prodotti e servizi seguita dall’interferenza dell’RNA. Per generare costrutti DsiRNA (dicer-substrati personalizzati) mirati al gene Fut8 , selezionare lo strumento Progettazione seguito dalla scheda Genera DsiRNA personalizzato . Immettere il numero di adesione Fut8 o inserire manualmente la sequenza genica per iniziare. In questo studio, le sequenze Fut8 proposte da entrambe le voci “CHO-K1” e “Chinese Hamster” sono state ottenute da https://chogenome.org e utilizzate per generare DsiRNA. La maggior parte dei geni ha diverse varianti di trascrizione ed è importante verificare che il DsiRNA sia attivo su tutte le varianti riportate nell’assemblaggio corrente. Selezionare l’opzione per eseguire una ricerca “BLAST manuale” poiché il genoma della cellula CHO non è attualmente disponibile come “genoma di riferimento” sul sito Web IDT. Questo passaggio cerca corrispondenze tra sequenze DsiRNA personalizzate e il genoma di interesse. Fare clic su Cerca per generare sequenze DsiRNA. A sua volta, valutare la specificità di ciascun DsiRNA utilizzando la funzione “Manual BLAST” con il codice fiscale: 10029 (linee cellulari CHO e criceto cinese). I risultati della copertura delle query indicano che i costrutti DsiRNA corrispondono a Fut8 (comprese le varianti di trascrizione Fut8 ) al 100%, mentre la complementarità con bersagli non intenzionali è ≤76. Verificare che il DsiRNA si rivolga specificamente a Fut8 per garantire che il contenuto di GC sia compreso tra il 30% e il 50%. Un basso contenuto di GC è associato a un legame debole e non specifico, mentre un alto contenuto di GC inibisce lo svolgimento e il caricamento del siRNA nel complesso RISC36. Selezionare tre DsiRNA da utilizzare negli studi di trasfezione (Tabella 1), ognuno mirato a una diversa posizione del gene Fut8 . Acquista un DsiRNA predefinito non mirato o criptato da IDT per esperimenti di controllo. All’arrivo, centrifugare il DsiRNA a 13.300 x g per 1 minuto a pellet prima di aprire il tubo. Ricostituire ogni DsiRNA liofilizzato in tampone duplex privo di nucleasi (fornito da IDT) in una soluzione madre da 100 μM. Ad esempio, aggiungere 20 μL di tampone a 2 nmol di DsiRNA per ottenere uno stock di 100 μM. Per garantire una miscelazione sufficiente, incubare le soluzioni stock a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente su uno shaker orbitale (50 rpm, orbita di 16 mm). Creare un master mix combinando 20 μL di ogni costrutto DsiRNA che ha come target Fut8 (100 μM di ciascun DsiRNA). Preparare aliquote e conservare a -20 °C. Bersaglio DsiRNA Sequenza GC (%) Struttura A 5′ GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3′ 36% 5′ GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCUC 3′ Struttura B 5′ AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3′ 32% 5′ AAGGAAAAACAUCCAUUCUCAUUCUGA 3′ Struttura C 5′ AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3′ 32% 5′ GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCG 3′ Tabella 1. Sequenze di DsiRNA utilizzate per il knockdown di Fut8. Sequenze generate da IDT che prendono di mira Fut8 nei genomi di criceti cinesi e cellule CHO K1. Vengono mostrate (rispettivamente) le sequenze di senso e antisenso per ciascun costrutto e viene visualizzato il contenuto GC di ciascuna struttura. Ristampato da Kotidis et al. 52. 2. Trasfezione di DsiRNA Ravvivare le cellule CHO che esprimono un anticorpo monoclonale IgG37 utilizzando condizioni di coltura adatte alla linea cellulare di interesse.NOTA: Le cellule utilizzate in questo studio sono state generate utilizzando il sistema della glutammina sintetasi (GS), in cui la GS endogena è inibita dalla L-metionina solfossimina (MSX) per migliorare la selezione di rari cloni ad alta produzione. Pertanto, utilizzare MSX solo se richiesto dalla linea cellulare scelta. Scongelare un flaconcino di cellule per 2-3 minuti a bagnomaria impostato a 37 °C. Pulire l’esterno del flaconcino con etanolo al 70% (v/v) e continuare tutto il lavoro in un armadio di biosicurezza di classe II. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 mL contenente 9 mL di mezzo preriscaldato appropriato per la linea cellulare scelta. Pellet le celle per centrifugazione a 100 x g per 5 min. Rimuovere con cura e scartare il mezzo senza disturbare il pellet cellulare. Quindi, risospendere il pellet di cella in 10 ml di terreno preriscaldato e prendere un’aliquota per il conteggio. Colorare le cellule con tripano blu se si conta con un emocitometro o una macchia appropriata per distinguere le cellule vive / morte quando si utilizza un contatore cellulare automatizzato. Seguendo uno dei due metodi di enumerazione, trasferire un volume appropriato di sospensione cellulare in un matraccio di Erlenmeyer da 125 mL ad una densità cellulare vitale di 3 x 105 celle·mL-1 in 30 mL di mezzo (con integrazione facoltativa di 50 μM MSX). Trasferire le celle in un incubatore impostato a 36,5 °C, 5% CO2 e posizionarle su una piattaforma vibrante a 150 giri /min (orbita di 16 mm). Cellule di passaggio ogni 3-4 giorni ad una densità di semina di 2 x 105 celle·mL-1 e un volume di lavoro di 50 mL in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL. Se si utilizza MSX, interrompere l’integrazione dopo il primo passaggio. Celle di passaggio 2x oltre allo scongelamento. Trasfezione Valutare la densità cellulare e assicurarsi che la vitalità cellulare sia superiore al 90%. Pulire accuratamente l’armadio di biosicurezza e tutte le apparecchiature con etanolo al 70% (v/v) e una soluzione inibitrice della RNasi per evitare la contaminazione. Celle a pellet a 100 x g per 5 minuti e risospese in mezzo preriscaldato ad una densità cellulare vitale di 5 x 106 celle·mL-1. Trasferire 8 μL (equivalenti a 1 μM) della miscela o del controllo principale DsiRNA a una cuvetta di elettroporazione sterile (0,4 cm). Quindi, trasferire 800 μL della sospensione cellulare (equivalente a 4 x 106 celle) nella stessa cuvetta e assicurarsi che entrambi i componenti siano miscelati. Fornire le seguenti condizioni di impulso: 1200 V, 0,1 ms, forma d’onda quadra. Trasferire la sospensione cellulare dalla cuvetta a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, avendo cura di evitare materiale simile alla schiuma. Recuperare le cellule nell’incubatore (36,5 °C, 5% CO2) senza agitare per 10 min. Aggiungere 800 μL di mezzi preribalizzati per ottenere un volume finale di 1,6 mL per pozzetto e restituire le cellule trasfettate all’incubatore per la crescita (36,5 °C, 5% CO2) mentre si agita a 150 giri / min (orbita di 16 mm). Raccogli i supernatanti e le cellule a 48 ore dopo la trasfezione.Punto di arresto: il surnatante di coltura cellulare può essere mantenuto a -20 °C; tuttavia, è consigliabile che la lisi cellulare venga eseguita immediatamente dopo la raccolta del pellet cellulare per evitare la degradazione delle proteine. I supernatanti sono utilizzati nella fase 3, nella fase 4 e nella fase 5, mentre i pellet cellulari vengono utilizzati nella fase 6. 3. Quantificazione e purificazione delle IgG Misurare la concentrazione di IgG utilizzando l’interferometria a biostrato o un altro metodo di scelta. Idratare la proteina Un biosensore punta nel diluente campione per 10-30 min. Nel frattempo, trasferire le sospensioni cellulari in tubi centrifughi da 15 ml e celle a pellet a 100 x g per 5 minuti o rimuovere le celle mediante filtrazione attraverso un filtro nitrocellulosa da 0,45 μm. Senza disturbare il pellet, trasferire con cura il surnatante isolato contenente IgG in un tubo centrifugo pulito. Utilizzare le seguenti impostazioni per l’interferometria del biostrato: velocità dello shaker, 2200 rpm; tempo di esecuzione, 60 s. Questi parametri saranno utilizzati per misurare tutti i campioni e i controlli. Una volta che le punte del biosensore sono idratate, creare una curva standard utilizzando uno standard IgG (4 μL di ogni concentrazione). Quantificare le concentrazioni del campione caricando 4 μL del surnatante cellulare. Pulire l’apparecchio con salviette prive di lanugine tra ogni campione. Collegare la curva standard ai campioni sconosciuti per interpolare la velocità di legame dei campioni sconosciuti. Salva i dati ed esportali come file csv o PDF. Purificazione IgG Preparare un tampone di eluizione contenente glicina 0,2 M (pH 2,5) e sterilizzare passando attraverso un filtro da 0,22 μm. Filtrare 1 mL del surnatante isolato a temperatura ambiente utilizzando tubi filtranti microcentrifuga da 0,22 μm fino a quando l’intero surnatante non scorre attraverso. Pellet 150-200 μL di perle di agarosio della proteina A in tubi di centrifuga da 1,5 mL a 100 x g per 3 minuti ed scartare il surnatante. Quindi, lavare le perle della proteina A con 150-200 μL di terreno di coltura cellulare e ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante. Sospendere le perle equilibrate della proteina A con 1 mL dei supernatanti preparati di cui al punto 3.2.3. e caricare in un tubo di polipropilene da 1 mL. Fissare il tubo di polipropilene su un miscelatore rotativo (orbita di 15 mm) e ruotare a 30 giri/min per 60-90 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C. Al termine dell’incubazione, raccogliere il flusso e lavare le perline con 1 mL di 1x PBS per rimuovere eventuali proteine non legate. Raccogli anche la frazione di lavaggio. Eluire IgG dalle perle della proteina A aggiungendo 3 ml di tampone di eluizione alla colonna di polipropilene. Raccogliere le frazioni sequenziali che drenano dalla colonna (500 μL ciascuna) in tubi etichettati. Facoltativo: se l’anticorpo purificato deve essere conservato, neutralizzare il tampone di eluizione aggiungendo 25 μL di 1 M Tris pH 9,5. Salta questo passaggio se l’anticorpo verrà elaborato immediatamente tramite scambio tampone, ecc.NOTA: Tutte le parti della purificazione (flusso, lavaggi e tutte le frazioni di eluizione) devono essere mantenute assicurandosi che la proteina bersaglio non venga persa. Questi esempi possono anche aiutare durante la risoluzione dei problemi se la purificazione non ha esito positivo. Utilizzare la prima eluizione (eluizione A) per la lavorazione a valle, ma mantenere tutte le altre frazioni se dovessero essere richieste in futuro. 4. Scambio tampone e concentrazione del campione Buffer di eluizione IgG di Exchange con 1x PBS. Caricare l’eluizione A su un concentratore centrifugo cutoff a peso molecolare da 3 kDa. Fare riferimento alla guida del produttore quando si seleziona una colonna MWCO appropriata. In questo esperimento, una dimensione dei pori più piccola garantisce la massima ritenzione delle proteine secrete, ma aumenta anche il tempo di centrifugazione. Centrifuga a 13.300 x g per 40-50 min a 4 °C. La centrifugazione è completa quando il volume residuo è uguale o inferiore a 50 μL. Scartare il flusso attraverso e aggiungere 500 μL di PBS prehilled (4 °C) per diluire il surnatante residuo. Centrifugare nuovamente il campione utilizzando le stesse condizioni (13.300 x g per 40-50 min a 4 °C) fino a quando rimangono 50 μL di surnatante residuo. Aggiungere 500 μL di PBS prechilled (4 °C) 1x per diluire il surnatante residuo e ripetere nuovamente il processo di centrifugazione per ottenere una diluizione 100x del surnatante. Concentrare il surnatante ad una concentrazione finale di ~2,5 g· L-1 in 40 μL o meno per garantire la compatibilità con il metodo di analisi del glicano.NOTA: 100 μg devono essere caricati per l’analisi del glicano.Punto di arresto: le IgG concentrate (in 1x PBS) possono essere conservate a -20 °C e scongelate prima dell’analisi del glicano. 5. Analisi del glicano Eseguire l’analisi del glicano utilizzando l’elettroforesi su gel capillare secondo le istruzioni del produttore. Trasferire 200 μL della soluzione di perline magnetiche in un tubo PCR da 0,2 mL e posizionarlo sul supporto magnetico per separare le perline dal surnatante. Rimuovere con attenzione il surnatante e rimuovere i tubi dal supporto magnetico. Aggiungere il campione proteico purificato e il vortice per garantire una miscelazione completa. Aggiungere il tampone di denaturazione (in dotazione) alla provetta del campione e incubare per 8 minuti a 60 °C. Tenere aperte le provette campione per prestazioni di reazione ottimali. Aggiungere PNGase F (500 unità per campione) e incubare per 20 minuti a 60 °C per scindere i glicani dagli anticorpi purificati. Dopo il rilascio di N-glicani, chiudere la provetta del campione e il vortice. Aggiungere acetonitrile, vortice e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Posizionare le provette campione nel supporto magnetico per separare le perline dalla soluzione. Utilizzare una pipetta per rimuovere con cura il surnatante senza toccare le perline. In una cappa aspirante, aggiungere al campione la soluzione di etichettatura glicane contenente un fluoroforo. Vortice per garantire una miscelazione sufficiente e incubare a 60 °C per 20 minuti (coperchi aperti). Lavare il campione 3 volte in acetonitrile per rimuovere il colorante in eccesso. Quindi, eluire i glicani etichettati in acqua DDI (in dotazione). Posizionare la provetta del campione nel supporto magnetico per separare le perline dal surnatante contenente glicani purificati ed etichettati. Preparare e caricare lo standard della scala del glucosio, gli standard di bracketing e i campioni nelle posizioni del vassoio designate. Eseguire il protocollo di analisi del glicano. Utilizzare un software appropriato per analizzare e identificare i glicani presenti nel campione.NOTA: assicurarsi che la temperatura nel blocco di calore sia accurata per un’incubazione efficiente. 6. Macchia occidentale Quantificare l’efficienza di abbattimento utilizzando l’analisi western blot con un anticorpo anti-α-1,6-fucosiltransferasi. Gel di poliacrilammide e ricette tampone sono disponibili presso fornitori commerciali38,39. A 48 ore dopo la trasfezione, contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato e determinare il volume della sospensione cellulare equivalente a 5 x 106 cellule. Trasferire il volume appropriato di sospensione cellulare da ciascuna condizione sperimentale a un tubo centrifugo sterile da 1,5 mL e pellet a 13.200 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Lisare le cellule con 200 μL di tampone di lisi (adatto per l’estrazione di proteine da cellule di mammifero) contenente cocktail inibitore della proteasi v/v all’1% a temperatura ambiente per 10 min. Agitare delicatamente la miscela durante l’incubazione (50 giri/min, orbita di 16 mm). Per rimuovere i detriti cellulari, centrifugare il lisato a 13.200 x g per 10 minuti e quindi trasferire il lisato eliminato in un tubo sterile da 1,5 ml. Misurare la concentrazione proteica di ciascun lisato utilizzando uno spettrofotometro a 280 nm. Successivamente, preparare aliquote di ciascun campione aggiustate per avere la stessa concentrazione proteica. Denaturare i campioni proteici mediante incubazione a 100 °C per 10-15 min in colorante di carico del campione DTT-SDS; la concentrazione finale del colorante è 1x. Caricare 15 μL dei campioni denaturati e 5 μL di scala proteica prestained in un gel SDS-PAGE con gel risolutivo al 12,5% per una separazione efficiente. Eseguire i campioni a 25 mA per gel per 90 minuti o fino a quando il fronte colorante raggiunge l’estremità del gel. Rimuovere con attenzione il gel dalla cassetta e incubare in 1x tampone di trasferimento contenente metanolo. Preparare il sistema di trasferimento a umido e attivare una membrana PVDF con metanolo. Assemblare il gel e la membrana PVDF per il trasferimento a umido, posizionare un blocco di ghiaccio nel serbatoio di trasferimento e immergere l’intero serbatoio nel ghiaccio per garantire che le condizioni di trasferimento rimangano fredde. Funzionamento a 350 mA/100 V per 60 min. Bloccare la membrana incubando in una soluzione bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente mentre si agita delicatamente su uno shaker orbitale a 50 rpm (orbita di 16 mm). Risciacquare la membrana con acqua sterile per 5 minuti e ripetere. Quindi, utilizzare un bisturi pulito per tagliare con cura la membrana orizzontalmente a ~ 50 kDa, utilizzando la scala proteica visibile come guida. Incubare la membrana che ospita proteine superiori a 50 kDa con anticorpo anti-α-1,6-fucosiltransferasi a 1:1000 in un tampone diluente anticorpale. Incubare la membrana con proteine immobilizzate inferiori a 50 kDa con anti-GAPDH a 1:10.000 in tampone diluente. Le membrane possono essere incubate per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C. Lavare le membrane per 5 minuti (x3) e quindi incubare con un anticorpo secondario appropriato per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Eseguire 3 lavaggi con un tampone di lavaggio per 5 minuti, seguito da 3 lavaggi con acqua. Quindi, sviluppare la membrana con un substrato cromogenico (o un reagente di rilevamento appropriato) fino a quando non compaiono bande (1-60 min). Risciacquare la membrana 2x con acqua, quindi lasciarla asciugare. Acquisire un’immagine della membrana ed eseguire l’analisi densitometrica40. Per calcolare l’espressione proteica relativa in ciascun campione, calcolare prima il rapporto del segnale GAPDH nei campioni. Questo è il fattore di normalizzazione per ogni campione che corregge le discrepanze nel caricamento del campione. Dividere l’intensità del segnale FUT8 (per ogni corsia) per il fattore di normalizzazione della corsia corrispondente per ottenere l’espressione relativa della proteina FUT8.

Representative Results

L’analisi Western blot ha mostrato una ridotta espressione proteica fuT8 nelle cellule trasfettate con una miscela di tre costrutti fut8 DsiRNA. Nei campioni di controllo trasfettati con DsiRNA non mirato, FUT8 è apparso come una doppia banda a ~ 65 e 70 kDa. Poiché il peso molecolare previsto di FUT8 è di 66 kDa, una riduzione dell’intensità del segnale della banda di peso molecolare inferiore è indicativa del silenziamento genico. Per confermare e quantificare il silenziamento genico, il livello della proteina FUT8 è stato normalizzato al livello relativo della proteina GAPDH. L’analisi Western blot ha rilevato due bande per GAPDH a ~ 37 e 35 kDa. La banda di peso molecolare più elevata corrisponde alla dimensione proteica prevista ed è, quindi, utilizzata nei calcoli di normalizzazione. Quando normalizzata rispetto ai livelli di proteina GAPDH, l’espressione della proteina FUT8 è stata ridotta fino al 60% (Figura 1). In linea con l’osservazione del knockdown genico a 48 ore dopo la trasfezione, i corrispondenti campioni di mAb sono stati elaborati per l’analisi da CGE-LIF. Le strutture glicani delle cellule knockdown hanno mostrato una diminuzione della fucosilazione. Questa tendenza è stata più pronunciata nelle strutture agalattosilate (G0F) e osservata in misura minore nelle strutture galattosilate (G1F, G1F’ e G2F). Da questo set di dati, la fucosilazione totale del nucleo IgG è scesa a ~ 75%, in calo rispetto a ~ 95% di fucosilazione del nucleo osservata per la condizione di controllo negativa (Figura 2). È stata prevista una maggiore riduzione della fucosilazione del nucleo data la diminuzione del ~ 60% dei livelli di proteina FUT8. Riflettendoci, è interessante notare che il glicoprofilo rappresenta mAbs glicosilati che si sono accumulati in un periodo di 48 ore dalla trasfezione, mentre il silenziamento genico rappresenta i livelli proteici presenti solo al momento della raccolta. Un ulteriore esame di questo metodo di abbattimento ha comportato la variazione della concentrazione di DsiRNA, del tempo di raccolta e delle condizioni di elettroporazione. Ogni fattore è stato sondato individualmente per determinarne la rilevanza. L’impatto delle condizioni dell’impulso di elettroporazione sulla fucosilazione del nucleo e sulla vitalità cellulare è catturato negli esperimenti B, C, D ed E. Questi risultati dimostrano una doppia riduzione della fucosilazione del nucleo dall’elettroporazione utilizzando due impulsi a onda quadra (Esperimento C) rispetto a un singolo impulso a onda quadra (Esperimento B), senza differenze significative nella vitalità cellulare (Tabella 2). La condizione di elettroporazione e3 (esperimento D) ha portato alla più bassa vitalità cellulare (~ 90%) e resa IgG in questo momento. Tuttavia, le cellule sopravvissute all’evento di elettroporazione sono state moderatamente trasfettate, come evidenziato dalla diminuzione di circa il 10% della fucosilazione del nucleo (Tabella 2). È interessante notare che l’esperimento D ha utilizzato condizioni di elettroporazione che hanno fornito la maggiore riduzione della fucosilazione del nucleo (14,7%), ma erano evidentemente dannose per la vitalità cellulare (91% -93% di vitalità). Questa serie limitata di esperimenti illustra la necessità di determinare le impostazioni di elettroporazione che consentono una sufficiente permeabilizzazione della membrana cellulare senza causare danni irrevocabili. È anche interessante notare il ruolo della concentrazione di siRNA e del tempo di raccolta sulla fucosilazione del nucleo. Nel complesso, l’aumento della concentrazione di siRNA ha una maggiore influenza sulla fucosilazione del nucleo rispetto all’aumento del tempo di raccolta (esperimenti B, F, G rispetto agli esperimenti A, B, H). In esperimenti futuri, sarebbe interessante titolare le concentrazioni di siRNA fornite dal metodo di elettroporazione e2. Figura 1. Diagramma di flusso sperimentale. Le fasi di glicoingegneria e analisi del campione sono rappresentate con il tempo associato richiesto per ogni fase. La progettazione del siRNA richiede alcune ore, a seconda del numero di bersagli genici o costrutti per bersaglio genico. La trasfezione delle cellule CHO con siRNA è completa in poche ore e le cellule trasformate vengono lasciate crescere per 48 ore. I pellet cellulari e i supernatanti vengono raccolti in poche ore. I pellet cellulari vengono lisati e le proteine intracellulari vengono separate su una SDS PAGE e successivamente blotted e sondate con anticorpi contro il gene bersaglio. I glicani sono scissi da anticorpi purificati e analizzati da CGE-LIF. Questi test possono richiedere 1 giorno ciascuno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Conferma dell’interferenza dell’RNA. Western blot detection of α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) protein levels in samples treated with Fut8 or non-targeting control DsiRNA. Le bande corrispondenti a FUT8 sono più intense nel controllo rispetto ai campioni di knockdown fut8. Anche il livello di proteina GAPDH è stato valutato al fine di normalizzare l’espressione genica bersaglio. Tutti i campioni sono stati prelevati dall’esperimento G (vedi Tabella 2). Ristampato da Kotidis et al. 52. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Effetto del knockdown di Fut8 sulla glicosilazione cumulativa di IgG a 48 h. Uno spostamento nella distribuzione del glicano viene rilevato nei campioni knockdown. In particolare, l’abbondanza relativa delle principali strutture fucosilate del nucleo (G0F) è ridotta mentre le specie afucosilate sono aumentate nell’esperimento di knockdown. Le misurazioni sono state eseguite da campioni dell’esperimento G (vedere Tabella 2). I triplicati biologici eseguiti per ogni esperimento sono stati miscelati dopo la raccolta per ridurre l’onere dell’analisi a valle. Ristampato da Kotidis et al. 52. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nome dell’esperimento Metodo di elettroporazione Concentrazione di DsiRNA (nΜ) Tempo di raccolta (h) Vitalità (%) Xv (106 celle·mL-1) Titolo IgG (mg· L-1) Differenza nella core-fucosilazione (%) ExpA_Negative e1 500 24 98.3 4.71 122.5 – ExpA_Knockdown e1 500 24 98.3 4.9 110.3 4.08 ExpB_Negative e1 500 48 95.6 9.55 453.3 – ExpB_Knockdown e1 500 48 96.7 9.61 469 5.38 ExpC_Negative e2 500 48 96.3 9.91 449.3 – ExpC_Knockdown e2 500 48 96.7 11 454.6 11.42 ExpD_Negative E3 500 48 90.6 6.25 318.5 – ExpD_Knockdown E3 500 48 89.1 6.09 311.85 9.71 ExpE_Negative E4 500 48 91.1 7.2 380.3 – ExpE_Knockdown E4 500 48 93.3 7.79 422.8 14.7 ExpF_Negative e1 750 48 96.2 9.7 501 – ExpF_Knockdown e1 750 48 95.7 9.76 504.6 9.9 ExpG_Negative e1 1000 48 96.1 11.1 422.6 – ExpG_Knockdown e1 1000 48 95.9 9.73 499.3 17.26 ExpH_Negative e1 500 72 94.4 14.3 925.8 – ExpH_Knockdown e1 500 72 95 13.5 1018.4 7.37 Tabella 2. Ottimizzazione della trasfezione. Le modifiche iterative del metodo di elettroporazione, della concentrazione di DsiRNA e del tempo di raccolta hanno portato a cambiamenti nella vitalità cellulare, nella densità cellulare vitale, nel titolo IgG al momento del raccolto e nelle differenze nella fucosilazione del nucleo. Ogni esperimento ha confrontato il knockdown e il rispettivo controllo negativo per determinare se la modifica produce l’effetto desiderato (cioè una diminuzione della fucosilazione). Le impostazioni di elettroporazione erano le seguenti: e1: 1200 V, 0,1 ms, forma d’onda quadrata; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s tra gli impulsi, forma d’onda quadrata; e3: 150 V, 20 ms, forma d’onda quadrata; e4: 250 V, 500 μF, decadimento esponenziale. Ristampato da Kotidis et al. 52.

Discussion

Le vie di glicosilazione coinvolgono una complessa rete metabolica di enzimi e proteine accessorie. Sezionare la funzione dei costituenti del percorso è scoraggiante se si basa solo su strategie convenzionali di ingegneria genetica knockout o knockin. Un approccio alternativo consiste nello screening preliminare dei membri di un percorso utilizzando un test transitorio di perdita di funzione. A tal fine, sono stati combinati due protocolli rapidi, RNAi e CGE-LIF detection, per creare un modo più efficiente per caratterizzare i geni della glicosilazione. Il metodo descritto richiede 5-7 giorni per il completamento rispetto ai metodi convenzionali che potenzialmente richiedono diverse settimane per il completamento. Inoltre, gli ambienti di ricerca con capacità di automazione potrebbero sfruttare questo metodo per selezionare più candidati genetici di quanto possibile con la gestione manuale.

Il successo di una campagna di glicoingegneria transitoria dipende in gran parte dal design del siRNA. I progetti DsiRNA personalizzati devono seguire le regole precedentemente delineate o, per facilità, gli utenti possono optare per sequenze preprogettate disponibili in commercio. Come altre strategie di modificazione genica, l’RNAi ha il potenziale per effetti off-target. Pertanto, gli utenti sono incoraggiati a valutare il targeting genico non intenzionale con metodi computazionali41. Le scelte di progettazione sperimentale possono anche aiutare a limitare gli effetti fuori bersaglio. Kittler et al. hanno dimostrato che la consegna multiplexata di siRNA ha portato a una riduzione degli effetti off-target42. Anche se questo sembra controintuitivo, si suggerisce che un master mix riduca la concentrazione di ciascun costrutto di siRNA, limitando così l’opportunità di silenziamento genico off-target. Un ulteriore vantaggio è che la trasfezione simultanea di strutture di siRNA che colpiscono lo stesso gene aumenta la probabilità di successo dell’RNAi. L’uso di un master mix garantisce inoltre la coerenza tra campioni e repliche e accelera il processo di trasfezione. Dopo uno screening iniziale di costrutti di siRNA misti, un altro esperimento può essere condotto utilizzando singoli costrutti per accertare l’efficienza RNAi di ciascuna sequenza. In questo e in altri studi di knockdown, fino a tre siRNA sono stati raggruppati e consegnati alle cellule 43,44,45. Tuttavia, può essere desiderabile esaminare più di tre siRNA contemporaneamente per colpire in modo efficiente un singolo gene o per indirizzare diversi geni. In effetti, uno studio ha dimostrato il silenziamento multiscelato mediato da siRNA di un massimo di sei geni a livelli paragonabili al silenziamento dei singoli geni46. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per determinare il numero massimo di costrutti di siRNA che possono essere utilizzati in una piscina senza compromettere l’efficienza del silenziamento. La strategia multiplex è stata proposta da Martin et al. per migliorare il ritmo degli esperimenti di screening della libreria RNAi46, e un concetto simile potrebbe rivelarsi utile per lo screening dei geni di glicosilazione.

Il protocollo qui descritto funge da proof-of-concept con l’aspettativa che vengano eseguiti esperimenti successivi per convalidare altri geni di glicosilazione. I nuovi geni di interesse possono essere insoliti o meno popolari di Fut8 e gli anticorpi primari per rilevare il silenziamento genico possono essere scarsi o non disponibili. In questo scenario, metodi alternativi come RT-PCR possono essere utilizzati per quantificare il silenziamento genico47, ma va notato che RT-PCR rileva l’mRNA piuttosto che le proteine. Quando sono disponibili anticorpi per il western blotting, un problema comune è la scarsa rilevazione o la presenza di bande non specifiche. Sono disponibili guide alla risoluzione dei problemi per aiutare gli utenti a risolvere problemi comuni e queste tendono a includere una gamma di soluzioni come la titolazione degli anticorpi primari, il blocco alternativo e le condizioni di rilevamento48,49. In questo studio, FUT8 è apparso inaspettatamente come una doppia banda a ~ 65 e ~ 70 kDa. È possibile che la banda ~70 kDa rappresenti FUT8 glicosilato. Prove di letteratura da linee cellulari umane descrivono la glicosilazione legata all’O a Thr 56450,51, un sito che è conservato nel criceto cinese, e le sequenze CHO K1 FUT8.

Come accennato in precedenza, le vie di glicosilazione spesso coinvolgono una complessa serie di enzimi. L’attuale protocollo è stato sviluppato, ottimizzato e dimostrato utilizzando una reazione di glicosilazione monogenica controllata da Fut8. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per confermare la robustezza di questo metodo quando il gene bersaglio codifica un enzima con cinetica alternativa e livelli di espressione o una via regolata da isoenzimi con funzioni ridondanti.

Nel complesso, la capacità di silenziare rapidamente i geni e rilevare glicoprofili IgG modificati è uno strumento utile nello sforzo verso anticorpi glicoingegnerizzati personalizzati. Approfondimenti da studi simili a breve termine possono essere applicati per generare cellule glicoingegnerizzate stabili da utilizzare in saggi a lungo termine come la coltura a batch alimentato. Al di fuori del contesto farmaceutico, questo metodo contribuisce allo studio della biologia del glicano ed evidenzia l’importante funzione dei glicani nello sviluppo, nella salute e nella malattia.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PK ringrazia il Dipartimento di Ingegneria Chimica, Imperial College di Londra, per la sua borsa di studio. RD ringrazia il Consiglio di ricerca sulle biotecnologie e le scienze biologiche del Regno Unito per la sua studentship. MM è finanziato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council del Regno Unito (riferimento alla sovvenzione: BB/S006206/1). IAG ringrazia l’Irish Research Council (Borsa di studio n. GOIPG/2017/1049) e CONACyT (Borsa di studio n. 438330).

Materials

32 Karat software SCIEX contact manufacturer Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.
Acetonitrile, HPLC grade Sigma Aldrich 34851 Solvent.
Anti-FUT8 antibody AbCam ab198741 Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.
Anti-GAPDH antibody AbCam ab181602 Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.
BioDrop Spectrophotometer Biochrom 80 3006 55 Instrument used to quantify protein concentration.
BLItz ForteBio 45 5000 Instrument. Label-Free Protein Analysis System.
BRAND Haemocytometer Sigma Alrich BR717810 Counting chamber device
Capillary cartridge SCIEX A55625 Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 µm outer diameter (o.d), x 50 µm inner diameter (i.d).
C100HT Glycan analysis—capillary electrophoresis SCIEX contact manufacturer Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.
CD CHO Medium Thermo Fisher Scientific 10743029 Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.
Centrifuge tubes, 15 mL Greiner Bio 188261 Sterile polypropylene tube.
Centrifuge tubes, 50 mL Greiner Bio 227270 Sterile polypropylene tube.
CHO IgG MedImmune Gift Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144 1x PBS, without calcium or magnesium.
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL Corning 431143 Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.
Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL Corning 431144 Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.
Fast Glycan Labelling and Analysis kit SCIEX B94499PTO Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.
Fut8 DsiRNA IDT Custom Custom designed DsiRNA targetting Fut8.
Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm Bio-Rad 1652088 Electroporation cuvette.
Gene Pulser Xcell Eukaryotic System Bio-Rad 165 2661 Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.
Immobilon-FL PVDF  membrane Merck-Millipore IPFL00010 Immunoblot transfer membrane, low background.
L-Methionine sulfoximine (MSX) Sigma Aldrich M5379 Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 10623111 Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 78505 Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific 10365710 Solvent.
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 616201 Autoclavable tubes.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system Bio-Rad 1658035FC Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.
NC-Slide A8 ChemoMetec 942 0003 8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.
Negative Control DsiRNA, 5 nmol IDT 51 01 14 04 Non-targeting DsiRNA.
Nuclease-free duplex buffer IDT 11-01-03-01 Reconstitution buffer for DsiRNA.
NucleoCounter NC-250 Chemometec contact manufacturer Instrument. Automated Cell Analyzer
Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa Thermo Fisher Scientific 26616 Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.
PCR tubes Greiner Bio 608281 Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.
Pipette filter tips sterilised  (10, 200, 1000 µL) Gibson F171203, F171503, F171703 Sterile filter tips to avoid RNA contamination.
PNGase F enzyme New England Biolabs P0704S Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.
Polypropylene columns, 1 mL Qiagen 34924 Columns for gravity-flow chromatography.
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P8340 Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases
Protein-A Agarose Beads Merck-Millipore 16 125 For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.
Protein-A biosensor ForteBio 18 5010 Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.
RNaseZap Invitrogen AM9780 Removes RNAse contamination.
Sample dilutent ForteBio 18 1104 Activate Protein A tips.
Serological pipets (5, 10, 25 mL) Corning 4487, 4488, 4489 Used for sterile cell culture tecniques.
Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF Sigma Aldrich 296813 Reducing agent.
Solution 18 ChemoMetec 910-3018 Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
Spin-X Centrifuge Tube Filters Corning 8161  0.22 µm pore, Cellulose Acetate membrane.
Suspension plate with lid, 6-well Greiner Bio 657 185 Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.
Syringe filters,  0.22 μm Sartorius 514 7011 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)
Syringes with Luer lock tip, 20 mL Fisher Scientific 10569215 For secure connection with syringe filter.
Trypan Blue solution Gibco 15250061 Stains dead and dying cells.
Vivaspin 500, 3,000 MWCO Sartorius VS0191 Polyethersulfone
WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit Thermo Fisher Scientific WB7105 Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Jefferis, R. Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 226-234 (2009).
  2. Rathore, A. S., Winkle, H. Quality by design for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 27 (1), 26-34 (2009).
  3. Eon-Duval, A., Broly, H., Gleixner, R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: An assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnology Progress. 28 (3), 608-622 (2012).
  4. Lalonde, M. -. E., Durocher, Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 251, 128-140 (2017).
  5. Mimura, Y., et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein & Cell. 9 (1), 47-62 (2018).
  6. Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36 (12), 1136-1145 (2018).
  7. Zhang, M., Koskie, K., Ross, J. S., Kayser, K. J., Caple, M. V. Enhancing glycoprotein sialylation by targeted gene silencing in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. , (2010).
  8. Kanda, Y., et al. et al. of a GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout host cell line: a new strategy for generating completely non-fucosylated recombinant therapeutics. Journal of Biotechnology. 130 (3), 300-310 (2007).
  9. Umaña, P., Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H., Bailey, J. E. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. Nature Biotechnology. 17 (2), 176-180 (1999).
  10. Xu, X., et al. et al. genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
  11. Chan, K. F., et al. et al. of GDP-fucose transporter gene (Slc35c1) in CHO cells by ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9 for production of fucose-free antibodies. Biotechnology Journal. 11 (3), 399-414 (2016).
  12. Zhang, P., et al. Identification of functional elements of the GDP-fucose transporter SLC35C1 using a novel Chinese hamster ovary mutant. Glycobiology. 22 (7), 897-911 (2012).
  13. Amann, T., et al. Genetic engineering approaches to improve posttranslational modification of biopharmaceuticals in different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2778-2796 (2019).
  14. Karottki, K. J., et al. Awakening dormant glycosyltransferases in CHO cells with CRISPRa. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 593-598 (2020).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  16. Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D., Hannon, G. J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404 (6775), 293-296 (2000).
  17. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  18. Shields, R. L., et al. et al. of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human FcγRIII and antibody-dependent cellular toxicity. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
  19. Shinkawa, T., et al. et al. Absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
  20. Mori, K., et al. Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function of produced antibodies using FUT8 siRNA. Biotechnology and Bioengineering. 88 (7), 901-908 (2004).
  21. Imai-Nishiya, H., et al. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC. BMC Biotechnology. 7, 84 (2007).
  22. Beuger, V., et al. et al. silencing of fucosyltransferase 8 in Chinese-hamster ovary cells for the production of antibodies with enhanced antibody immune effector function. Biotechnology and Applied Biochemistry. 53 (1), 31 (2009).
  23. Templeton, N., Dean, J., Reddy, P., Young, J. D. Peak antibody production is associated with increased oxidative metabolism in an industrially relevant fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 2013-2024 (2013).
  24. Hussain, H., et al. A comparative analysis of recombinant Fab and full-length antibody production in Chinese hamster ovary cells. Biotechnology and Bioengineering. 118 (12), 4815-4828 (2021).
  25. Shimoyama, H., et al. Partial silencing of fucosyltransferase 8 gene expression inhibits proliferation of Ishikawa cells, a cell line of endometrial cancer. Biochemistry and Biophysics Reports. 22, 100740 (2020).
  26. Tummala, S., et al. Evaluation of exogenous siRNA addition as a metabolic engineering tool for modifying biopharmaceuticals. Biotechnology Progress. 29 (2), 415-424 (2013).
  27. Carillo, S., et al. Comparing different domains of analysis for the characterisation of N-glycans on monoclonal antibodies. Journal of Pharmaceutical Analysis. 10 (1), 23-34 (2020).
  28. Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles-Part 2: Mass spectrometric methods. mAbs. 7 (4), 732-742 (2015).
  29. Donini, R., Haslam, S. M., Kontoravdi, C. Glycoengineering Chinese hamster ovary cells: a short history. Biochemical Society Transactions. 49 (2), 915-931 (2021).
  30. Szigeti, M., Chapman, J., Borza, B., Guttman, A. Quantitative assessment of mAb Fc glycosylation of CQA importance by capillary electrophoresis. ELECTROPHORESIS. 39 (18), 2340-2343 (2018).
  31. Ruhaak, L. R., et al. Optimized workflow for preparation of APTS-labeled N-glycans allowing high-throughput analysis of human plasma glycomes using 48-channel multiplexed CGE-LIF. Journal of Proteome Research. 9 (12), 6655-6664 (2010).
  32. Patenaude, A. -. M., et al. N-glycosylation analysis of mouse immunoglobulin G isolated from dried blood spots. Electrophoresis. 42 (24), 2615-2618 (2021).
  33. Karst, D. J., et al. Modulation and modeling of monoclonal antibody N-linked glycosylation in mammalian cell perfusion reactors. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 1978-1990 (2017).
  34. Dadouch, M., Ladner, Y., Perrin, C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: sample preparation, separation, and detection. Separations. 8 (1), 4 (2021).
  35. Fakhr, E., Zare, F., Teimoori-Toolabi, L. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Therapy. 23 (4), 73-82 (2016).
  36. Birmingham, A., et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature Protocols. 2 (9), 2068-2078 (2007).
  37. Makrydaki, E., et al. . Immobilised enzyme cascade for targeted glycosylation. , (2022).
  38. . Bulletin_6201.pdf Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6201.pdf (2022)
  39. . Bulletin_6376.pdf Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6201.pdf (2022)
  40. . Dot Blot Analysis Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/index.html (2022)
  41. Yilmazel, B., et al. Online GESS: prediction of miRNA-like off-target effects in large-scale RNAi screen data by seed region analysis. BMC Bioinformatics. 15 (1), 192 (2014).
  42. Kittler, R., et al. Genome-wide resources of endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nature Methods. 4 (4), 337-344 (2007).
  43. Stec, E., et al. A multiplexed siRNA screening strategy to identify genes in the PARP pathway. Journal of Biomolecular Screening. 17 (10), 1316-1328 (2012).
  44. Brown, J. M., et al. Ligand conjugated multimeric siRNAs enable enhanced uptake and multiplexed gene silencing. Nucleic Acid Therapeutics. 29 (5), 231-244 (2019).
  45. Parsons, B. D., Schindler, A., Evans, D. H., Foley, E. A direct phenotypic comparison of siRNA pools and multiple individual duplexes in a functional assay. PLoS One. 4 (12), 8471 (2009).
  46. Martin, S. E., et al. Multiplexing siRNAs to compress RNAi-based screen size in human cells. Nucleic Acids Research. 35 (8), 57 (2007).
  47. Popp, O., Moser, S., Zielonka, J., Rüger, P., Hansen, S., Plöttner, O. Development of a pre-glycoengineered CHO-K1 host cell line for the expression of antibodies with enhanced Fc mediated effector function. mAbs. 10 (2), 290-303 (2018).
  48. Yang, P. -. C., Mahmood, T. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  49. Troubleshooting Western Blots with the Western Blot Doctor. Bio-Rad Laboratories Available from: https://www.bio-rad.com/en-uk/applications-technologies/troubleshooting-western-blots-with-western-blot-doctor?ID=MIW4HR15 (2022)
  50. Steentoft, C., et al. Precision mapping of the human O-GalNAc glycoproteome through SimpleCell technology. EMBO. 32 (10), 1478-1488 (2013).
  51. . FUT8 – Alpha-(1,6)-fucosyltransferase – Proteomics Available from: https://www.nextprot.org/entry/NX_Q9BYC5/proteomics (2022)
  52. Kotidis, P., et al. Rapid antibody glycoengineering in CHO cells via RNA interference and CGE-LIF N-glycomics. Methods in Molecular Biology. 2370, 147-167 (2022).

Tags

GlycoengineeringChinese Hamster Ovary CellsAntibodyGlycosylationTransientHigh-throughputGlyco-profileEnzyme FunctionalityAntibody ActivityCritical Quality AttributeCancerCell TransfectionWestern BlotDsiRNAElectroporationIgG PurificationCentrifugal Concentrator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Marbiah, M., Kotidis, P., Donini, R., Gómez, I. A., Jimenez del Val, I., Haslam, S. M., Polizzi, K. M., Kontoravdi, C. Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells. J. Vis. Exp. (184), e63872, doi:10.3791/63872 (2022).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image