Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Gerard Castro-Linares; Jeffrey den Haan; Francois Iv; Carla Silva Martins; Aur&#233;lie Bertin; Manos Mavrakis; Gijsje H. Koenderink

doi:10.3791/63871

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

Hücresiz Sulandırma için Rekombinant Septin Komplekslerinin Saflaştırılması ve Kalite Kontrolü

Published: June 23, 2022

doi:

10.3791/63871

Gerard Castro-Linares¹, Jeffrey den Haan¹, Francois Iv², Carla Silva Martins², Aurélie Bertin³, Manos Mavrakis², Gijsje H. Koenderink¹

¹Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology, ²Institut Fresnel, CNRS UMR7249,Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, ³Institut Curie, Université PSL,Sorbonne Université

Summary

Hücre iskeleti proteinlerinin in vitro resusyonu, bu proteinlerin temel fonksiyonel özelliklerini anlamak için hayati bir araçtır. Bu yazıda, hücre bölünmesi ve göçünde merkezi bir rol oynayan rekombinant septin komplekslerinin saflaştırılması ve kalitesinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

Septinler, hetero-oligomerik komplekslerden sitoiskelet filamentleri ve yüksek dereceli yapılar oluşturabilen korunmuş ökaryotik GTP bağlayıcı proteinlerin bir ailesidir. Göç ve hücre bölünmesi gibi önemli hücresel fonksiyonlara katılmak için diğer sitoiskelet bileşenleri ve hücre zarı ile etkileşime girerler. Septinlerin birçok etkileşiminin karmaşıklığı, çok sayıda septin geni (insanlarda 13) ve septinlerin farklı alt birim bileşimlerine sahip hetero-oligomerik kompleksler oluşturma kabiliyeti nedeniyle, hücresiz sulandırma, septin biyolojisinin temellerini anlamak için hayati bir stratejidir. Bu yazıda ilk olarak rekombinant septinlerin hetero-oligomerik formlarında iki aşamalı bir afinite kromatografisi yaklaşımı kullanılarak saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Daha sonra, septin komplekslerinin saflığını ve bütünlüğünü kontrol etmek için kullanılan kalite kontrol süreci detaylandırılmıştır. Bu işlem, doğal ve denatüre edici jel elektroforezi, negatif leke elektron mikroskobu ve interferometrik saçılma mikroskobunu birleştirir. Son olarak, negatif leke elektron mikroskobu ve floresan mikroskobu kullanılarak septin komplekslerinin polimerizasyon kabiliyetini kontrol etme işleminin bir açıklaması verilmiştir. Bu, Drosophila septin heksameerlerinin yanı sıra farklı septin_9 izoformlarını içeren yüksek kaliteli insan septin heksamerleri ve oktamerleri üretmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Introduction

Hücre iskeleti klasik olarak aktin filamentleri, mikrotübüller ve ara filamentlerden oluşan üç bileşenli bir sistem olarak tanımlanmıştır 1, ancak son zamanlarda septinler sitoiskelet^1’in dördüncü bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Septinler, ökaryotlar^2’de korunan GTP bağlayıcı proteinlerin bir ailesidir. Septinler, hücre bölünmesi³, hücre-hücre adezyonu⁴, hücre motilitesi⁵, morfogenez⁶, hücresel enfeksiyon⁷ ve hücre polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi⁸ gibi birçok hücresel fonksiyonda rol oynar. Önemli işlevlerine rağmen, septinlerin bu tür süreçlere nasıl dahil oldukları tam olarak anlaşılamamıştır.

Septin protein ailesi, protein dizisi benzerliği^2’ye bağlı olarak birkaç alt gruba (sınıflandırmaya bağlı olarak dört veya yedi) ayrılır. Farklı alt ailelerin üyeleri, filamentlerin yapı taşları olan ve sırayla demetler, halkalar ve örgüler 1,9,10,11,12 gibi daha yüksek dereceli yapılara monte edilen palindromik hetero-oligomerik kompleksler oluşturabilir. Daha fazla moleküler karmaşıklık, farklı ekleme varyantlarının varlığından kaynaklanmaktadır; bir örnek, farklı ekleme varyantlarının spesifik işlevleri için kanıtların bulunduğu insan ^SEPT9’dur ^13,14,15. Ek olarak, hetero-oligomerlerin uzunluğu türlere ve hücre tipine bağlıdır. Örneğin, Caenorhabditis elegans septinleri tetramerler 16’yı, Drosophila melanogaster septinleri hexamers^{17’yi (Şekil 1A}), Saccharomyces cerevisiae septinleri oktamerler^18’i ve insan septinleri hem hexamers hem de octamers^19’u oluşturur (Şekil ^1A). Septin izoformlarının, ekleme varyantlarının ve aynı alt aileden translasyonel olarak modifiye edilmiş septinlerin komplekste birbirlerinin yerine geçme kabiliyeti ve farklı büyüklükteki hetero-oligomerlerin (birlikte) varlığı, farklı hetero-oligomerik komplekslerin hücresel fonksiyonlarını tanımlamayı zorlaştırmıştır¹².

Septinlerin bir başka ilginç yeteneği, hücredeki birçok bağlayıcı ortakla etkileşime girme yetenekleridir. Septinler plazma zarını ve membranöz organelleri interfaz ve hücre bölünmesi sırasında bağlar^20,21,22. Bölünen hücrelerde, septinler sitokinez 26,27 sırasında anilin^23,24,25 ve aktin ve miyozin ile işbirliği ^yapar. Sitokinezinin geç evrelerinde, septinler orta vücut absiszyonu için taşıma (ESCRT) sistemi için gerekli endozomal sıralama komplekslerini düzenlemektedir²⁸. Ek olarak, fazlar arası hücrelerdeki hücrelerin aktin korteksi ve aktin stres lifleri üzerinde bulunan septin kanıtı da vardır 29,30,31. Spesifik hücre tiplerinde, septinler ayrıca mikrotübül sitoiskeletini bağlar ve düzenler^32,33.

Tüm bu özellikler, septinleri çalışmak için çok ilginç bir protein sistemi haline getirir, aynı zamanda zorlu bir sistemdir. Çok sayıda septin alt biriminin (insanlarda ekleme varyantlarını saymadan 13 gen²) aynı alt aileden septin alt birimlerinin birbirlerinin yerine geçme ve farklı büyüklükteki hetero-oligomerler oluşturma potansiyeli ile kombinasyonu, genetik manipülasyon yoluyla belirli bir septinin hücresel fonksiyonu hakkında bir sonuç çıkarmayı zorlaştırmaktadır. Ayrıca, septinlerin çoklu etkileşimleri, sitoiskelet veya membran bileşenlerine yönelik ilaçlar³⁴ gibi yaygın araştırma araçlarının etkilerini yorumlamayı zor bir görev haline getirmektedir.

Bu durumun üstesinden gelmenin bir yolu, hücrelerdeki araştırmayı septinlerin in vitro (hücresiz) yeniden sulandırılmasıyla tamamlamaktır. In vitro sulandırma, belirli bir alt birim bileşimi ve uzunluğu^18,35,36,37 olan tek tip septin hetero-oligomerlerin izolasyonuna izin verir. Bu kompleks daha sonra,^{septinlerin 38,39,40} septinlerinin temel yapısal ve fizikokimyasal özelliklerini keşfetmek için tek başına veya model biyomembranlar ^11,41,42^, aktin filamentleri ^10,27 veya mikrotübüller ^32,36 gibi istenen ortaklarla kombinasyon halinde kontrollü bir ortamda incelenebilir. Etkileşim.

Bu nedenle, farklı septin komplekslerini verimli bir şekilde saflaştırmak için güvenilir bir yöntem, septin araştırması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, aynı protokolü kullanarak bile, farklı saflaştırmalar proteinlere farklı aktivite / işlevsellik ve hatta bütünlük sağlayabilir. Enzimler gibi ticari olarak temin edilebilen proteinler için, işlevsellik ve enzimatik aktivite dikkatlice doğrulanmıştır⁴³. Sitoiskelet veya septinler gibi yapısal proteinler için dikkatli bir kalite kontrolü uygulamak zor olabilir, ancak laboratuvarlar arasında deneylerin karşılaştırılabilir hale getirilmesi önemlidir.

Bu yazıda, Escherichia coli hücrelerinde mono- veya bi-sistronik yapılar içeren iki vektörün eşzamanlı ekspresyonuna dayanarak yüksek kaliteli rekombinant septinleri hetero-oligomerik formlarında saflaştırmak için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır (Tablo 1). Yöntem, hem₆ etiketli septin hem de Strep-II etiketli septin içeren septin hetero-oligomerlerini yakalamak için iki aşamalı bir afinite kromatografisi yaklaşımından oluşur (Şekil 1B, C). İlk olarak Iv ve ark.10’da tanımlanan bu protokol, Drosophila septin hexamers 11,27,35, human septin hexamers¹⁰ ve farklı doğal (izoform 1, 3 ve 5)^10,32 veya mutasyona uğramış SEPT9 izoformları ³² içeren birkaç insan septin oktamerini saflaştırmak için kullanılmıştır. . Ayrıca, saflaştırılmış septinlerin kalitesini değerlendirmek için bir dizi tekniğin tanımı verilmiştir. İlk olarak, septin alt birimlerinin bütünlüğü ve doğru stokiyometrisi, denatüre elektroforez ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak kontrol edilir. Daha sonra, doğru moleküler kütleye sahip hetero-oligomerlerin varlığı ve karmaşık instabilitenin göstergesi olan monomerlerin veya daha küçük oligomerlerin varlığı, interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT) yoluyla doğal elektroforez ve kütle fotometrisi ile incelenir. Son olarak, son adım, floresan mikroskobu ve TEM kullanılarak septinlerin polimerizasyon aktivitesinin değerlendirilmesinden oluşur.

Şekil 1: Saflaştırma stratejisi . (A) İnsan (solda) ve Drosophila (sağda) hücrelerinde bulunan septin hetero-oligomerlerinin şemaları. Sayılar belirtilen gruplardan septin alt birimlerini, P ise Fıstık’ı gösterir. İnsan SEPT9, izoformlarından herhangi biri olabilir. Septin alt birimleri asimetrik bir şekle sahiptir ve insan heksamerinin üstünde sırasıyla NC ve G ile gösterildiği gibi, NC: NC ve G: G arayüzü olmak üzere iki ayrı arayüzle uzunlamasına ilişkilidir. (B,C) İki aşamalı kromatografi stratejisinin şematik gösterimi, (B) insan septin heksamserleri ve (C) oktamerler için gösterilmiştir. H his-etiketlerini gösterirken, S Strep-II-etiketlerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Septin hetero-oligomerlerin saflaştırılması Bakteri hücrelerinin ekspresyon vektörleri ile birlikte dönüşümüİfade için kullanılacak bir pnEA ve bir pnCS plazmid44 kombinasyonunu seçin. Septin hetero-oligomer 10,35’in istenen alt birim bileşimine ve floresan etiketlemenin gerekli olup olmadığına bağlı olarak kombinasyonu seçin.NOT: C-terminal etiketli monomerik süper klasör GFP (msfGFP)-etiketli SEPT2 (insan septinleri için) veya msfGFP- veya monomerik geliştirilmiş GFP (mEGFP)-DSep2 ( Drosophila septinleri için) burada kullanılmıştır (Tablo 1). Her plazmidin 1 μL’sini (~1 ng/μL) 100 μL yetkin BL21 Escherichia coli hücresine pipet edin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri 40 s boyunca 42 ° C’de bir su banyosuna yerleştirin ve ardından hemen buz üzerinde 3 dakika boyunca inkübe edin. Hücre süspansiyonuna 0.9 mL lizojen et suyu (LB) ortamı ekleyin ve hücrelerin 37 ° C’de 1 saat büyümesine izin verin. 100 μg / mL ampisilin ve 100 μg / mL spektinomisin içeren sıcak LB-agar plakaları üzerindeki hücrelerin 100 μL’lik plakası ve 37 ° C’de gece boyunca inkübe edilir. Bakteri ön kültürü yetiştirin250 mL’lik bir Erlenmeyer şişesini, 100 μg/mL ampisilin ve 100 μg/mL spektinomisin içeren 100 mL Müthiş et suyu (TB) veya LB ortamı ile doldurun. Steril bir aşılama döngüsüne sahip LB-agar plakasından tek bir koloni seçin ve adım 1.2.1’den itibaren taze ortama aktarın. Döner çalkalayıcı inkübatörde 37 °C’de gece boyunca veya en az 6 saat boyunca inkübe edin.NOT: Bu kültürden, bakteriyel süspansiyon 1: 1’in gliserol ile karıştırılmasıyla bir gliserol stoğu hazırlanabilir ve -80 ° C’de saklanabilir. Bu hisse senedi adım 1.2.2’de kullanılabilir. yeni dönüştürülmüş bir koloni yerine. Bakteri kültürü ve protein ekspresyon indüksiyonu100 mL yetiştirilen bakteriyi, 50 μg / mL ampisilin ve 50 μg / mL spektinomisin içeren 5 L TB veya LB’ye aktarın. Bu kültürü, etiketlenmemiş septinler için 2-3 aralığında 600 nm dalga boyunda veya msfGFP / mEGFP etiketli septinler için 0.6-0.8 aralığında ölçülen bir optik yoğunluğa (OD) ulaşana kadar bir çalkalayıcı inkübatörde 37 ° C’de büyütün ve 0.5 mM IPTG’lik bir son konsantrasyon ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Etiketli septinler için alt OD, bir sonraki adımda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, daha uzun ekspresyon sürelerinde ölüm fazına ulaşmaktan kaçınmaktır. Etiketlenmemiş septin hetero-oligomerlerini eksprese eden hücreleri 37 ° C’de 3 saat boyunca veya msfGFP etiketli hetero-oligomerleri eksprese eden hücreleri 17 ° C’de bir gecede inkübe edin.NOT: Daha zengin TB ortamının kullanılmasıyla kolaylaştırılan etiketsiz kompleksler için kısa protein ekspresyon süresi, protein bozulmasını önlemek için seçilir. Etiketli kompleksler için daha düşük sıcaklıkla birleştirilen daha uzun ifade süresi, msfGFP etiketinin doğru katlanmasına izin vermek için seçilir. Bakteriyel lizis ve lizat berraklaştırmaNOT: Saflaştırma prosedüründe bu noktadan itibaren, proteolitik protein bozulmasını veya aktivite kaybını önlemek için protein içeren çözeltiyi buz üzerinde veya her zaman 4 ° C’de tutun.Kültürlenmiş hücreleri, 4 ° C’de 20 dakika boyunca 4.000 x g’de santrifüj yaparak toplayın. Süper natantı atın.İsteğe bağlı olarak, peleti bu adımda çıtçıtlayın ve maksimum 6 ay boyunca -80 ° C’de saklayın. Bu seçenek seçilirse, devam etmeden önce peleti buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun. Peleti 100 mL lizis tamponunda çözün (Tablo 2) ve hücreleri lize edin. Aşağıdaki iki seçenekten birini belirleyin30 s AÇIK ve 59 s KAPALI 7 döngülerinde% 30 genlik kullanan bir uç sonicator ile sonicate (ayarların sonicator-bağımlı olduğunu unutmayın). Fransız basınındaki hücreleri en az 3 kat geçirerek parçalayın. 4 ° C’de 30 dakika boyunca 20.000 x g’de santrifüj yaparak hücre lizatını netleştirin ve süpernatant tutun. Adım 1.5.1 ile başlamanız önerilir. bu santrifüj adımı sırasında. İsteğe bağlı olarak, bölüm 2’de açıklandığı gibi elektroforezi denatüre etmek için bir örnek alın. His etiketli proteinler için afinite kromatografisiNOT: Bu adım, bir nikel sütunu kullanarak insan SEPT2 veya Drosophila Sep1 içeren kompleksleri verir (Şekil 1B).Önceden paketlenmiş bir nikel sefarozun yüksek performanslı kromatografi kolonunu septin tamponu ile dengeleyin (Tablo 2). Arıtılmış süpernatantı kolona 1 mL / dak’da yükleyin ve bağlı proteini en az üç kolon hacmi septin tamponu ile yıkayın. Septin komplekslerini 1 mL/dk’da HisTrap elüsyon tamponu (Tablo 2) ile süzün ve 250 mM’lik bir imidazol konsantrasyonu elde etmek için 0,5 mL fraksiyonları toplayın. Hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi ile çevrimiçi olarak izlenen 280 nm’de veya bir mikro hacimli spektrofotometre ile saflaştırmadan sonra 280 nm’de elüatın optik emilimi ile belirtildiği gibi, septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin.NOT: İmidazol ışığı 280 nm’de emer. Bu muhtemelen protein zirvesinin septin elüsyonundan sonra neden sıfır emilime geri dönmediğini açıklar (Şekil 2A). Strep-II etiketli proteinler için afinite kromatografisiNOT: Bu adım, bir Strep-Tactin sütunu kullanarak insan SEPT7 (heksamer), insan SEPT9 (oktamerler) veya Drosophila yer fıstığı içeren kompleksler verir (Şekil 1B). Kromatografi kolonu, modifiye edilmiş bir biyotin-streptavidin sistemine dayanmaktadır. Protein, modifiye biyotin (Strep-II-etiketi) ile etiketlenir ve sütun, mühendislik ürünü bir streptavidin (Strep-Tactin) içerir. Biotin-streptavidin sisteminden modifiye edilmesine rağmen, Strep-Tactin-Strep-II-tag sistemi ile biotin-streptavidin sistemi arasında herhangi bir girişim yoktur. Tanımlanan sistem, biyotin ve streptavidin kullanılarak sulandırma tahlillerine müdahale edilmesini önlemek için kullanılır.Önceden paketlenmiş bir StrepTactin sefarozu yüksek performanslı kromatografi kolonunu septin tamponu ile dengeleyin (Tablo 2). Nikel kolonundan geri kazanılan septin içeren fraksiyonları 1 mL / dak’da yükleyin ve bağlı proteini en az üç kolon hacmi septin tamponu ile yıkayın. Septin komplekslerini 0 StrepTrap elüsyon tamponu (Tablo 2) ile 1 mL/dk’da süzün ve 2,5 mM desthiobiotin konsantrasyonu elde etmek için 0,5 mL fraksiyonları toplayın.NOT: StrepTrap elüsyon tamponundaki desthiobiotin taze olarak çözülmelidir. Bir FPLC sistemi ile çevrimiçi olarak izlenen 280 nm’de veya bir mikro hacimli spektrofotometre ile saflaştırmadan sonra 280 nm’de elüatın optik emilimi ile belirtildiği gibi, septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin.NOT: Denatüre edici elektroforez genellikle bu noktada kolon yıkama ve septin fraksiyonlarının örnekleri ile yapılır. Sütunların sırası, ayırt edilemez sonuçlarla, yani adım 1.4’ten sonra açıklığa kavuşturulmuş lizat ile tersine çevrilebilir. Strep-Tactin afinite kromatografisine ve ardından nikel afinite kromatografisine tabi tutulabilir. Diyaliz ve depolamaDethiobiotin’i nihai depolama çözeltisinden çıkarmak için, septin komplekslerini, 30 kDa MWCO diyaliz membranı kullanarak gece boyunca 1 mM DTT ile desteklenmiş septin tamponuna karşı ~ 1:300 numune-tampon hacim oranında çevirin (Tablo 2) veya en az 4 saat boyunca 4 °C’de. İsteğe bağlı olarak, septinleri 30 kDa MWCO santrifüj konsantrasyon sütunu kullanarak istenen konsantrasyona kadar konsantre edin. 280 nm’de çözelti optik absorbansı ile ölçülen ve ProtParam ile hesaplanan teorik bir yok olma katsayısı kullanılarak 5-7 μM’lik bir konsantrasyonu hedefleyin (Tablo 3). Aliquot, protein komplekslerini istenen aliquot boyutuna getirir, aliquot’u çırpın-dondurur ve -80 ° C’de saklar.NOT: Proteinin 6 aydan fazla saklanmaması önerilir. Ek olarak, özellikle protein önerilen süreden daha uzun süre saklanırsa, düzenli kalite kontrol deneyleri yapılması önerilir. 2. Septin hetero-oligomerin saflığının ve bütünlüğünün kalite kontrolü NOT: Hetero-oligomer kalite kontrolü, çözeltide bulunan septin komplekslerinin kütlesinin ve bütünlüğünün tespit edilmesini sağlayan bir dizi biyokimyasal ve görüntüleme tekniğinden oluşur. Doğru bileşenlerle septin hetero-oligomer oluşumunu kontrol etmek için denatüre elektroforezSeçilen fraksiyonların 10 μL’sini 10 μL 2x SDS numune tamponu ile karıştırın, bunları önceden dökülmüş %4- TGX jel üzerine yükleyin ve sistemi Tris/glisin/SDS çalışan tamponla doldurun. Elektroforezi 200 V’ta 35 dakika boyunca çalıştırın ve sonuçları görselleştirmek için jeli (Malzeme Tablosu) boyayın. Bireysel septin proteinlerinin ve septin hetero-oligomerik komplekslerinin moleküler ağırlıkları Tablo 3’te bulunabilir. Kontrast ters çevrilmiş bir görüntüde saflaştırılmış septinler içeren her şeritteki her bir bandın göreceli yoğunluğunu ölçün. Bunu, her bandın etrafındaki eşit büyüklükteki dikdörtgenlerin ve aynı şeritte herhangi bir bant bulunmayan bir bölgedeki eşit büyüklükteki dikdörtgenin ortalama yoğunluğunu hesaplayarak yapın. Ardından, her bandın yoğunluğunu bantsız bölgenin yoğunluğuna bölerek değerleri normalleştirin.NOT: Yoğunluk doymuşsa (örneğin, kontrast ters çevrilmiş bir görüntüdeki 8 bit görüntü için 255 değerleri), şeridi atlayın. Doğal elektroforez yoluyla topluluk ortalaması doğal boyut dağılımıBir gün önce 800 mL anot tamponu ve 200 mL açık mavi katot tamponu hazırlayın ve buzdolabında saklayın. Anot tamponunu hazırlamak için, 40 mL 20x akan tamponu 760 mL tip-I deiyonize su (I-su) ile seyreltin. Açık mavi katot tamponunu hazırlamak için, 10 mL 20x çalışan tampon ve 1 mL 20x katot katkı maddesini 189 mL I-su ile seyreltin. Çalışan tampon ve katot katkı maddesi bir kit (Malzeme Tablosu) ile birlikte gelir. ~500 ng septini gerekli miktarda numune tamponu (bu durumda, 4x numune tamponunun kullanılması nedeniyle 2,5 μL; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 μL’lik bir hacme ulaşmak için yeterli miktarda I-su ile karıştırarak numunenin 10 μL’sini hazırlayın. Numuneleri jel üzerine yükleyin ve sistemi buz gibi soğuk anot ve katot tamponlarıyla doldurun. Düşük akımlarda durmayan bir güç kaynağı ile elektroforezi 150 V’ta yaklaşık 115 dakika çalıştırın ve sonuçları görselleştirmek için jeli (Malzeme Tablosu) lekeleyin. Diziye göre hesaplanan tek proteinlerin ve komplekslerin moleküler ağırlıkları Tablo 3’te bulunabilir. İnterferometrik saçılma mikroskobu ile kütle fotometrisi kullanılarak tek moleküllü kütle dağılımı#1.5 cam slaytları, I-suyunda 5 dakika, izopropanolde 5 dakika ve son olarak I-suda 5 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirerek yıkayın. İki cam kaydırağı yumuşak bir azot gazı akışıyla kurutun ve slaytlardan birinin ortasına 7 μL’lik %0,01’lik bir Poli-L-Lizin (PLL) çözeltisi damlası yerleştirin. Ardından, diğer slaytın merkezini PLL damlasının üzerine yerleştirin ve kolay ayırma için iki slaytı dikey olarak yönlendirin. 30 s için kuluçka makinesi.I-water 1x ile bir beherin içine daldırarak ve doğrudan I-water 2x akışı uygulayarak yıkayın. Ardından, iki slaytı azot gazı akışıyla kurulayın. Bu slaytlar daha sonra kuru koşullarda oda sıcaklığında yaklaşık 6 hafta saklanabilir.NOT: Denemeyi doğru şekilde çalıştırmak için slaytın PLL ile işlenen tarafını etiketleyin. Deneyden hemen önce, 2 x 2, 3 x 2 veya 3 x 3 contadan oluşan bir parçayı kesin (sırasıyla 4, 6 veya 9 görüntüleme odası / slayt verir) ve cam slaytın PLL ile işlenmiş kısmına yapıştırın, cam slayt ve contaların herhangi bir kirli yüzeye temas etmesini önler. Sürgüyü hafif hizmet tipi bir silecek mendil üzerine yerleştirin ve contaların üzerinde hala koruyucu plastik olacak şekilde yapıştırmak için contalara pipet ucuyla bastırın. Septin tamponunu (Tablo 2) oda sıcaklığına ısıtın ve eldeki proteinleri çözün (daha sonra buz üzerinde tutun).NOT: iSCAT, bazı deterjanların ve protein sinyallerine benzeyen küçük moleküllerin sinyalini gösterir45. DTT bu küçük moleküllerden biridir ve bu yüzden bu deney için kullanılmaz. Depolanan septinden sadece bir DTT izi vardır. Contalı slaytı 19 μL septin tamponu içeren ticari kütle fotometri sistemine yerleştirin ve otomatik odaklama seçeneğini kullanarak mikroskopu odaklayın. Bulunan odağın doğru olup olmadığını kontrol etmek için üreticinin talimatlarını izleyin. Kurulumun bir parçası olan standart 100x hedefi burada kullanılır. Dosya > Yeni Proje veya Dosya Yükleme Projesi kullanarak verileri depolamak için bir proje klasörü oluşturun veya > yükleyin. 19 μL septin tampon damlası (adım 2.3.5) üzerine 1 μL numune pipeti, bunu yaparken hiçbir şeye dokunmayarak kızağın hareketini en aza indirirken odaklamak ve karıştırmak için kullanılır. Ardından, Kaydet’e tıklayarak 6.000 karelik bir video kaydedin.Doğru analiz için aşağıdaki numuneleri kaydedin: septin tamponu, sinyal-kütle oranının kalibrasyonu için protein kütle standardı (yeni bir kalibrasyon varsa ve çevresel koşullar değişmediyse, bu numune atlanabilir) ve DTT olmadan septin tamponunda seyreltilmiş 250 nM septin kompleksi (bu, ~ 12.5 nM’lik bir nihai konsantrasyon verir). Protein kütle dağılımını elde etmek için üreticinin yazılımını kullanarak videoları analiz edin. Aşağıdaki gibi kaliteli veriler olup olmadığını kontrol edin.Farklı septin hetero-oligomer boyutlarının zirveleri çok fazla örtüşüyorsa veya çok fazla olay algılanırsa (normal görüş alanı 128 piksel x 34 piksel olan ve 10,8 μm x 2,9 μm boyutlarına yayılan 6.000 karelik bir video için >3.500 olay), son septin konsantrasyonunu azaltın ve tekrar ölçün. Ölçülen tek moleküllerin yeterli sayısı yoksa (normal görüş alanına sahip 6.000 karelik bir video için en az 2.500-3.500), septin konsantrasyonunu artırın ve tekrar ölçün. Negatif leke geçirgenliği elektron mikroskobu ile septin komplekslerinin doğrudan görüntülenmesiNumuneleri septin tamponunda yaklaşık 50 nM’lik bir konsantrasyona kadar seyreltin ve boyama çözeltisini (I-suyunda% 2 uranil formatı veya uranil asetat) hazırlayın.NOT: Uranil format taze hazırlanmalıdır. Pipet, 4 μL seyreltilmiş septinleri parıltılı bir elektron mikroskobu ızgarasına yerleştirin ve 30 s boyunca inkübe edin. Bir filtre kağıdı kullanarak protein çözeltisinin çoğunu çıkarın ve gevşek adsorbe edilmiş septinleri çıkarmak için ızgarayı 2x’i septin tamponu ve 1x’i I-su ile yıkayın. 1 dakika boyunca I-water’da% 2 uranil asetat veya uranil format çözeltisi ile leke, boyama çözeltisini bir filtre kağıdı ile emilir ve ızgarayı birkaç dakika boyunca hava ile kurutur. Gelişmiş leke bölgelerini aramak ve seçilen bu alanlarda yaklaşık 100 görüntü toplamak için düzgün hizalanmış bir iletim elektron mikroskobu kullanarak ızgarayı tarayın. Yaklaşık 2 Å/piksel piksel boyutu elde etmek için görüntüleri en az 50.000x büyütmede ve -1 μm ile -2 μm arasında değişen bir bulanıklaştırma ile toplayın. 200 kV’luk bir hızlanma voltajı kullanın. Tercihen, mevcut edinme yazılımına bağlı olacak verileri toplamak için otomatik bir prosedür kullanın. Özel yazılım kullanarak 2B görüntü işleme gerçekleştirinÖzel bir yazılım kullanarak en az 2.000 parçacık kutulayın46. Daha fazla iyileştirme yapmadan sınıflar elde edilene kadar iki boyutlu hizalama ve sınıflandırmayı yinelemeli olarak gerçekleştirin. İlk hizalama ve sınıflandırma adımı, sınıflandırmada herhangi bir önyargıyı önlemek için referanssız olmalıdır. Ekstra bir sınıflandırma turu gerçekleştirmek için ilk referanssız sınıflandırmadan elde edilen ortalamaları yeni referanslar olarak kullanın. Daha fazla iyileştirme elde edilinceye kadar bu işlemi yinelemeli olarak tekrarlayın. Her sınıfın 50 ila 100 seçilmiş parçacığa dayandığından ve tek tek alt birimlerin açıkça görülebildiğinden emin olun. Farklı yazılım araçları kullanılabilir (Spider, Eman veya Relion)46,47,48. 3. Polimerizasyon analizi ile septin fonksiyonel kalite kontrolü NOT: İşlevsellik kalite kontrolü, polimerize septin komplekslerinin tespitine izin veren bir dizi görüntüleme tekniğinden oluşur. Aşağıda, etiketlenmemiş septinler “karanlık” septinler olarak adlandırılır ve etiketlenmemiş septinleri polimerize etmek için kullanılan tampon “karanlık” septin polimerizasyon tamponu (SPB) olarak adlandırılır. Floresan mikroskobu ile septin demeti görüntüleme5x fluoSPB (Tablo 2) ve koyu septin ve msfGFP-septinden oluşan septin karışımını, septin tamponu + 1 mM DTT’de istenen nihai konsantrasyondan altı kat daha yüksek konsantrasyonda hazırlayın. Bu tahlil için tipik bir konsantrasyon 300 nM’dir ve bu nedenle konsantrasyon bu karışım için 1.800 nM’dir. Bu özel sırayla, I-suyu (istenen son hacme kadar doldurmaya yetecek kadar), 5xfluoSPB (1:5’lik son seyreltme), 0,05 μM PCD ve ,67 septin karışımını (1:6’lık son seyreltme) karıştırarak septini polimerize edin. 10 μL için, 6.23 μL I-su, 2 μL 5xfluoSPB, 0.1 μL PCD (5 μM stoğu ile) ve 1.67 μL septin karışımı karıştırın. Bu karışımı oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Numuneleri fluoSPB ile yıkanmış bir görüntüleme odasına ekleyin (Tablo 2) ve septin demetlerini görüntüleyin. PLL-PEG pasifleştirilmiş akış kanalları, önceki araştırma10,32’de açıklandığı gibi, bu deney için iyi çalışır. Negatif leke iletimi elektron mikroskobu ile septin demeti hayal etme5x darkSPB (Tablo 2) ve septin tamponu + 1 mM DTT’de istenen son konsantrasyondan altı kat daha yüksek konsantrasyonda% 100 koyu septinden oluşan bir septin karışımı hazırlayın. Bu tahlil için tipik bir konsantrasyon 300 nM’dir ve bu nedenle konsantrasyon bu karışım için 1.800 nM’dir. Septin komplekslerini, bu özel sırayla, I-suyu (istenen son hacme kadar doldurmaya yetecek kadar),% 20 5xdarkSPB ve% 16.67 septin karışımını karıştırarak polimerize edin. 5 μL için, 3.16 μL I-su, 1 μL 5x darkSPB ve 0.83 μL septin karışımı karıştırın. Bu karışımı oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Parıltılı elektron mikroskobu ızgarasına 3-5 μL numune ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, sıvıyı bir filtre kağıdı ile emerek ve bir damla koyu SPB tamponu ekleyerek ızgarayı 2x darkSPB ile yıkayın (Tablo 2), 1x’i I-su ile yıkayın,% 2 uranil asetat ile ~ 30 s inkübe edin, lekeyi lekeleyin ve numuneyi birkaç dakika boyunca hava ile kurutun. Septin demetlerini 120 kV’ta ve 5.000x ile 60.000x arasındaki büyütmeleri 1-2 μm arasında bir bulanıklaştırma ile görüntüleyin.

Representative Results

Protokolde belirtildiği gibi, iki septin eksprese eden plazmid ile birlikte dönüştürülmüş 5 L E. coli hücresi büyütüldü ve septinlerin ekspresyonu IPTG eklenerek indüklendi. 3 saat sonra, hücreler santrifüjleme ile toplandı, lizis tamponunda yeniden askıya alındı ve sonikasyon ile lize edildi. Lisat daha sonra santrifüjleme ile netleştirildi ve berraklaştırılmış çözelti bir HisTrap sütununa uygulandı (Şekil 2A). İlk saflaştırmadan sonra, septin içeren fraksiyonlar bir araya getirildi ve bir StrepTrap sütununa uygulandı (Şekil 2B). Bu tipik olarak yaklaşık 3-5 mL ~ 1 μM septin kompleksi verir. Septin içeren fraksiyonları bir araya getirmeden önce, septin alt birimlerinin bütünlüğünü ve kompleksi oluşturan farklı septin alt birimleri arasındaki equimolar stokiyometrik oranı kontrol etmek için denatüre jel elektroforezi kullanılabilir. (Şekil 3A). Jel, septin alt birimlerinin moleküler ağırlıklarına (Tablo 3) karşılık gelen benzer şekilde yoğun bantlar gösteriyorsa, protokole devam edilebilir. Değilse, protokolü yeniden başlatmanız önerilir. SEPT9_i1 sahip insan septin oktameri için gösterilen örnekte, Şekil 3A , benzer yoğunluklara sahip SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 ve SEPT2’ye (yukarıdan aşağıya sırayla) karşılık gelen bantları açıkça göstermektedir; normalleştirilmiş yoğunluğun ‘luk güven aralığı 2 Eylül için 0,048 ± 1,128, 6 Eylül için 1,092 ± 0,034, 7 Eylül için 1,108 ± 0,040 ve 9 Eylül için 0,029 ± 1,067 idi. SEPT2 msfGFP ile etiketlenirse, SEPT9_i1 çok altına doğru kayacaktır. Kullanılan elektroforez sistemine ve SEPT7 için C-terminal TEV-Strep etiketinin varlığına bağlı olarak (etiketsiz SEPT7’den daha yavaş göç etmesini sağlar), SEPT7 ve SEPT6 bantları bazen karşılaştırılabilir moleküler ağırlıkları nedeniyle birleşir. Bir sonraki adım, fraksiyonları bir araya getirmek ve DTT ile septin tamponuna karşı çevirmektir. Diyalizden sonra, konsantrasyon çok düşükse (<2 μM) veya deneyler için daha yüksek bir konsantrasyona ihtiyaç duyulursa, protokolde açıklandığı gibi bir konsantrasyon adımı dahil edilebilir. 1 μM'nin altındaki konsantrasyonlar genellikle septinlerin kötü fonksiyonel kalitesini gösterir. 3.5 μM ile 7 μM arasındaki son septin kompleks konsantrasyonu, çoğu in vitro tahlil için iyi çalışır. Bu konsantrasyonlar genellikle konsantrasyondan sonraki hacim 0.5-1 mL’ye ulaştığında elde edilir. Şekil 2: Karanlık insan septinin saflaştırılmasına karşılık gelen örnek kromatogramlar octamers_9i1 . (A) HisTrap kolon kromatogramı. Septin elüsyon zirvesinden sonra, muhtemelen tampondaki imidazolün varlığından dolayı absorbans sıfıra geri dönmez. Havuzlanmış fraksiyon, elüsyon zirvesinin başlangıcından absorbans yaklaşık 250 mL’de stabilize olana kadar gitti. (B) StrepTrap sütun kromatogramı. Havuzlanmış fraksiyon, elüsyon zirvesinin başlangıcından absorbans 50 mL’de yaklaşık 0’a geri dönene kadar gitti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kalite kontrolüne devam etmek için, protokolde açıklandığı gibi doğal elektroforez uygulandı (Şekil 3B). Jellerde, bozulmamış hetero-oligomerlere karşılık gelen büyük bir bant ve genellikle dimerlere karşılık gelen küçük bir bant gözlenebilir. İnsan heksamerleri 242 kDa marker bandının biraz üzerinde bulunurken, oktamerler 480 kDa bandının üzerinde, hesaplanan moleküler kütlelerinin üzerinde bulunur. Bu bantların yeri, ökaryotik hücre ekstraktlarının batı leke analizi ile kontrol edildi32. msfGFP ile etiketleme, her SEPT2’yi bir msfGFP proteini ile eşleştirir. Bu, septin komplekslerinin moleküler ağırlığında 53.4 kDa’lık (26.7 kDa / msGFP molekülü) bir artışa neden olur. Bununla birlikte, doğal elektroforez jelinde, msfGFP etiketli komplekslerin görünür moleküler ağırlığı, etiketlenmemiş komplekslerinkinden ayırt edilemez. Septin komplekslerinin sağlam olup olmadığını test etmek için tamamlayıcı bir teknik, iSCAT mikroskobu ile kütle fotometrisidir. iSCAT, referans ışığına müdahale edilerek güçlendirilmiş bir cam slayta inen moleküllerin ışık saçılımını, tipik olarak lazerin cam slaytın altındaki yansımasını izler. Daha sonra, parçacıklara kontrast vermek için bir arka plan çıkarma yaklaşımı kullanılır. Bu düzeltme nedeniyle, sinyal parçacıkların camın üzerine inmesine veya ondan uzaklaşmasına bağlı olarak pozitif ve negatif değerler gösterir49. Tespit edilen sinyal, proteinlerin moleküler ağırlığı50 ile doğru orantılıdır. Bu nedenle, kütle standardına sahip bir sinyalden kütleye kalibrasyon, numune proteinlerinin kütlesini belirleyebilir. Şekil 3C, SEPT9_i1 içeren insan septin oktamerlerinin bir örneğini göstermektedir. Tespit edilen tek parçacıkların çoğu (~% 50), SEPT9_i1 (423 kDa) içeren tam oktamerler için beklenen moleküler ağırlığa sahiptir (Şekil 3C). Kütleleri 150-300 kDa arasında olan parçacıklar da vardır, ancak diğer septin türlerinin düşük miktarda olası varlığını gösteren net bir tepe noktası gözlenmez. Benzer şekilde, mEGFP etiketli Drosophila heksamerleri için tespit edilen tek parçacıkların çoğu, bozulmamış heksamerler (361 kDa) için beklenen moleküler bir ağırlığa sahiptir (Şekil 3D). 241 kDa’daki ek bir berrak zirve, iki fıstık proteini, bir DSep1 ve bir mEGFP-DSep2 içeren kararlı tetramerlerin varlığını gösterir. Son olarak, hem insan hem de sinek septin kompleksleri, muhtemelen DTT izi veya toplanan başka bir küçük molekül tarafından güçlendirilmiş, arsa45’in pozitif tarafında bir zirve gösteren monomerlerin ve dimerlerin bir karışımı olabilecek 80 kDa civarında bir zirve göstermektedir. Şekil 3: Oligomer kalite kontrolünün sonuçlarına örnekler . (A) Karanlık insan septin octamers_9i1 saflaştırılmasından elüsyon zirvesinin farklı fraksiyonlarını gösteren denatüre jel örneği. (B) Farklı septin komplekslerinin doğal elektroforez örneği. (C,D) 12.5 nM septin komplekslerinde kütle fotometrisinin histogram sonuçlarının farklı örnekleri: (C) karanlık insan septin octamers_9i1 ve (D) DSep1-msfGFP Drosophila septin heksameers. Çizgiler Gauss uyumlarıdır. (E) 25 nM karanlık insan septinin TEM görüntüsü, septin tamponunda octamers_9i1. Ölçek çubuğu = 200 nm. (F) SEPT2-msfGFP insan septin octamers_9i1 sınıf ortalama görüntüsü. msfGFP etiketleri iki uçta bulanık yoğunluklar olarak görünür. Ölçek çubuğu = 10 nm. Paneller (E) ve (F) The Company of Biologists’in telif hakkıdır ve izin alınarak Iv ve ark.10’dan uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Hem doğal jellerin hem de iSCAT’ın yalnızca topluluk ortalaması elde edilen bilgileri sağladığı göz önüne alındığında, komplekslerin bütünlüğünü ve saflığını doğrudan görselleştirme ile kontrol etmek için tek septin oligomerlerinin iletim elektron mikroskobu görüntülerinin sınıf ortalaması kullanılmıştır. Septin tamponundaki septin komplekslerinin TEM görüntülerinde, 24 nm (hexamers) veya 32 nm (oktamer) uzunluğunda çubuklar gözlenebilir. SEPT9_i1 içeren bir insan septin oktamerinin bir örneği Şekil 3E’de görülebilir. Sınıf bunların ortalamasını alırken, alt birimlerin her biri, Şekil 3F’de SEPT9_i1 sahip msfGFP etiketli insan oktamerinde görüldüğü gibi gözlemlenebilir ve sayılabilir. Oligomerin floresan olarak etiketlenmesi durumunda, çubukların sonunda SEPT2-msfGFP’ye karşılık gelen ekstra yoğunluklar gözlemlenebilir (Şekil 3F). Yukarıdaki tekniklerin kombinasyonu, doğru stokiyometrik orana ve yüksek saflığa sahip oktamerlerin (veya heksamerlerin) tarif edilen protokol kullanılarak saflaştırılabileceğini kanıtlamaktadır. Son olarak, son kalite kontrol kontrolü, septin komplekslerinin polimerizasyon yetenekleri açısından işlevselliği içindir. Düşük tuz konsantrasyonu varlığında (tarif edilen tampon 9 ile <150 mM KCl), septinler diğer proteinlerin veya negatif yüklü lipit membranlarının varlığında değilse, kendi kendine demetlerhalinde toplanırlar9. Septinler, yüksek (300 mM) KCl konsantrasyonuna sahip depolama tamponunda tutularak polimerizasyondan önlenir. Septin hetero-oligomerleri daha sonra aynı bileşime sahip bir tamponda 1: 6 hacim oranında seyreltilir, ancak 50 mM’lik son bir KCl konsantrasyonu elde etmek için KCl olmadan. Floresan görüntüleme yapmak için, bu tampon fotobeyazlatmadan korunmak için bir oksijen süpürme sistemi ve yanıp sönen bir baskılayıcı ile tamamlanmaktadır. TIRF mikroskopisinde, sığ TIRF alanı içinde küçük protein kümeleri gözlenebilir (~100 nm; Şekil 4A,B). Konfokal mikroskopta, çözelti içinde daha yükseğe doğru yüzen büyük filamentli yapı kümeleri görülebilir (Şekil 4C). Son olarak, TEM ile, TIRF tarafından gözlemlenen kümelere karşılık gelen küçük septin demetleri (Şekil 4D) ve konfokal mikroskopi ile gözlenen yapılara karşılık gelen büyük demetler (Şekil 4E) gözlemlenebilir. Şekil 4D, E’nin iç kısımları, her iki yapı tipinin de paralel olarak çalışan ve konik uçlu demetler oluşturan uzun, ince filamentlerden oluştuğunu ortaya koymaktadır. Birlikte, floresan ve TEM görüntüleri, saflaştırılmış septin komplekslerinin filamentlere polimerize olabileceğini ve bunun da kendi kendine demetler halinde toplandığını kanıtlamaktadır. Şekil 4: Polimerizasyon yeteneği kalite kontrolünün sonuçlarına örnekler. (A) fluoSPB’de 300 nM insan septin heksamerinin (% 10 msfGFP etiketli heksamer) TIRF görüntüsü. (B) fluoSPB’de SEPT9_i1 (octamers9_i1 msfGFP etiketli) içeren 300 nM insan septin oktamerinin TIRF görüntüsü. (C) FlüoSPB’de 300 nM insan septinin 0,5 μm aralığı ile ~30 μm boyunca Z-yığınlarının konfokal maksimum yoğunluk projeksiyonları octamers_9i3. (A-C) Ölçek çubuğu = 10 μm ve ters gri tonlamalı. (D,E) Örnek (D) küçük ve (E) büyük insan septin demetlerinin TEM görüntüleri darkSPB’de octamers_9i1. Girintiler, demet içinde paralel çalışan berrak filamentlerin gözlemlenebileceği bölgeleri gösterir. Ölçek çubukları = 500 nm. Paneller (C-E) telif hakkı The Company of Biologists’e aittir ve izin alınarak Iv ve ark.10’dan uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Plazmidlerin listesi. Bu protokolü takiben septin oligomerlerini saflaştırmak için plazmidler. Tüm plazmidler Addgene’de (ilk sütun) biriktirilmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 2: Arabelleklerin listesi. Septin oligomerlerinin saflaştırılması ve kalite kontrolünde kullanılan tampon bileşimleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 3: Moleküler ağırlıklar ve yok olma katsayıları. Kompleksin dizilerine dayanarak ProtParam ile hesaplanan 280 nm dalga boyundaki moleküler ağırlıkların (MW) ve optik yok olma katsayılarının (ε) listesi, septin alt birimlerinin, farklı septin komplekslerinin ve Tablo 1’de listelenen plazmidlerle saflaştırılabilen benzersiz septin alt birimlerinin (sadece MW) doğrusal füzyonunu varsayarsak. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan yöntem, önceden oluşturulmuş septin hetero-oligomerlerinin sağlam saflaştırılmasına ve kalite kontrolüne izin verir. Yöntemin doğru uygulanması için göz önünde bulundurulması gereken temel konulardan bazıları şunlardır. Kromatografik ayırmalardaki elüsyon adımları sırasında, septin komplekslerinin seyreltilmesini en aza indirmek için önerilen (veya daha düşük) akış hızını kullanmak önemlidir. Ek olarak, son konsantrasyon adımı sırasında proteinin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için, yoğunlaştırıcı kolon, çözelti filtreye karşı itilmeyecek şekilde yönlendirilir (yalnızca bir tarafta bir filtre olduğunda). Çözelti doğrudan filtreye giderse, protein ona çok daha fazla yapışır ve nihai verimi önemli ölçüde azaltır. Konsantrasyon adımının her zaman gerekli olmadığını düşünmek de önemlidir. Fraksiyonları sadece kromatogramdaki tepe noktasının etrafındaki dar bir aralıktan toplamak, çoğu sulandırma uygulaması (genellikle 10-300 nM arasında çalışan) için genellikle yeterince yüksek bir stok konsantrasyonu (>3.000 nM) verir. Son olarak, floresan mikroskobu ile septin komplekslerinin işlevselliğinin kalite kontrolü için, septin kompleksleri cama hevesle yapıştığından, mikroskopi slaytlarının yüzeyini doğru şekilde pasifleştirmek önemlidir. Cam slaytların pasivasyonu, PLL-PEG fonksiyonelleştirmesi yoluyla veya nötr (% 100 DOPC) destekli lipit çift katmanlı^11,32 oluşumu ile yapılabilir.

İlk olarak Iv ve ^ark.10’da açıklanan orijinal saflaştırma protokolü ile karşılaştırıldığında, tampon bileşimlerinde bir değişiklik vardır (Tablo 2). MgCl 2 konsantrasyonu 5 mM’den₂ mM’ye düşürüldü ve Tris-HCl’nin konsantrasyonu ve pH’ı sırasıyla 50 mM’den 20 mM’ye ve 8.0’dan 7.4’e düşürüldü. Bu değişiklikler, tampon koşullarının, insan septinlerinin lipid çift katmanları, aktin filamentleri ve mikrotübüller ^10,11,32 ile etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalarla uyumlu hale getirilmesi için yapılmıştır. Bunun nedeni, yazarların, F-tamponunda ATP’nin varlığının yanı sıra, bileşimi darkSPB’ninkiyle aynı olan F-tamponunda desteklenen lipit çift katmanları ve polimerize aktin oluşturmasıdır. Tampon değişimi, orijinal tamponlara kıyasla saflaştırılmış septinlerin kalitesinde veya ömründe herhangi bir değişiklik yaratmadı.

Bu saflaştırma yönteminin hala birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, farklı saflaştırma girişimleri, saflaştırılmış septin komplekslerinin demet oluşum kabiliyeti ile kontrol edildiği gibi, verim (0.5-1 mL 2-5 μM septin kompleksleri) ve fonksiyonel kalite bakımından değişebilir. Bu nedenle, bu makalede açıklanan kalite kontrollerini tutarlı bir şekilde yapmak çok önemlidir. İfade sürelerini ve bakteri kültürünün optik yoğunluğunu çok iyi kontrol etmek, verimdeki farkı azaltmaya yardımcı olabilir. İkincisi, bu arıtma boru hattı trimerler ve heksamerler veya tetramerler ve oktamerler arasında ayrım yapamaz (Şekil 1B). Bununla birlikte, kalite kontrol deneyleri, septin komplekslerinin çoğunun uzun oligomer formunda olduğunu kanıtlamak için kullanılabilir. Daha dar bir oligomer boyut dağılımının gerekli olması durumunda, adım 1.6 arasına boyut dışlama kromatografisi eklenebilir. ve adım 1.7. arıtma protokolünün. Bununla birlikte, bu isteğe bağlı adım, verimi önemli ölçüde azaltır ve kesinlikle gerekli olmadıkça önerilmez. Sonuncu, daha temel bir sınırlama, E. coli’nin rekombinant septin kompleksleri için bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Doğal olarak, bu sistem fosforilasyon, asetilasyon ve sumoilasyon 6,51,52,53 gibi hayvan hücrelerinde bildirilen post-translasyonel modifikasyonlara (PTM’ler) izin vermez. Bu posttranslasyonel modifikasyonlar, böcek veya insan hücrelerinde benzer bir saflaştırma stratejisi uygulanarak eklenebilir. Dahası, bu makale sadece septinlerin kendi başlarına yeniden yapılandırılmasını tartışmıştır, ancak hücrelerde yapılan çalışmalar, Borg ailesi 54,55 ve anilin 24,25,56’dan proteinler gibi düzenleyici proteinlerin, septinlerin montajı ve işlevleri üzerinde önemli ancak az anlaşılmış etkilere sahip olabileceğini ve bu nedenle in vitro olarak dahil edilmesinin önemli olduğunu göstermektedir. Çalışmaları. Borg proteinlerinin ve anilinin saflaştırılması için protokoller^54,57 olarak bildirilmiştir.

Burada bildirilen septin saflaştırma protokolü, septinleri oligomer formlarında doğru alt birim stokiyometri ile saflaştırmak için standartlaştırılmış bir yol sunarak, tek septin alt birimlerine dayanan daha önceki birçok in vitro çalışmaya göre önemli bir ilerleme sunmaktadır. Belirli bağlamlardaki bazı septinler tek bir alt ünite² olarak işlev görse de, mevcut literatür organı, hayvan hücrelerinde septinlerin çoğunlukla ^9,58 komplekslerinde işlev gördüğünü kuvvetle önermektedir. Bu nedenle, bu makalede ve diğerlerinde ^{10,11,18,32,35,36,37} olarak tanımlananlar gibi önceden oluşturulmuş hetero-oligomerlerin kullanımı^, septinlerin yapısal ve biyofiziksel özelliklerini in vitro yoluyla incelemek için büyük önem taşımaktadır. hücredeki işlevlerini incelemek için yeniden yapılanma. Ayrıca, septinler, membran ve sitoiskelet de dahil olmak üzere birçok etkileşim ortağına sahip kendi kendine birleşen proteinlerdir, bu da onları aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji^59,60,61 ve eğrilik^42,62,63 gibi membran biyofiziksel özelliklerinde protein kaynaklı değişikliklerin incelenmesi için büyük ilgi uyandırır.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay ve Katharina Häußermann’a kütle fotometrisi (iSCAT) deneylerindeki yardımları için teşekkür ederiz; Arjen Jakobi ve Wiel Evers, TEM’e yaptıkları yardımlar için; Lucia Baldauf, TIRF ile olan yardımlarından dolayı; Pascal Verdier-Pinard, doğal elektroforez ile ilgili tavsiyeleri için; Agata Szuba ve Marjolein Vinkenoog, Drosophila septin saflaştırma çabalarının ve Hücre ve Doku Görüntüleme’nin (PICT-IBiSA) kurulmasındaki yardımlarından dolayı, Fransız Ulusal Araştırma Altyapısı Fransa-BioImaging (ANR10-INBS-04) üyesi Institut Curie. Bu araştırma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nden (NWO / OCW) ‘BaSyC-Sentetik Bir Hücre İnşa Etmek’ Yerçekimi hibesi (024.003.019) ve Agence Nationale pour la Recherche’den (ANR, ANR-17-CE13-0014: “SEPTIMORF”; ANR-13-JSV8-0002-01: “SEPTIME”; ve ANR-20-CE11-0014-01: “SEPTSCORT”).

Materials

488nm laser combiner iLAS2	Gataca		TIRF microscope
488nm Sapphire laser lines	Coherent		Confocal microscope
4k X 4k F416 CMOS camera	TVIPS		For JEM-1400plus
4x sample buffer nativePAGE	Thermo Fisher scientific	BN2003
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813	To prevent blinking
AKTA pure 25 M1	GE healthcare	1680311
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518-25G
Carbon Type-B, 300 mesh EM grid	Ted pella	01813-F
Carbon Type-B, 300 mesh EM grid	Electron micoscopy sciences	CF300-Cu
Cover glass #1.5H	Thorslabs	CG15KH
CSU-X1-M1 confocal unit	Yokogawa		Confocal microscope
Desthiobiotin	Sigma-Aldrich	D1411-1G
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779
DNAse	Sigma-Aldrich	10104159001
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
Eclipse Ti2-E	Nikon instruments		Confocal microscope
EDTA-free protease inhibtor cocktail	Roche	481761
HisTrap HP, 5 mL	GE healthcare	29-0588-3
iLAS2 azimuthal TIRF illumination system	Gataca		TIRF microscope
Imidazole	Sigma-Aldrich	1202-1KG
InstantBlue Protein Gel Stain	Westburg Life Sciences	EP ab119211
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher scientific	10849040
iXon Ultra 888 EMCCD camera	Andor		Confocal microscope
iXon Ultra 897 EM-CCD	Andor		TIRF microscope
JEM-1400plus	JOEL		TEM microscope TUDelft
kappa-cassein	Sigma-Aldrich	C0406
LB broth	Sigma-Aldrich	L3022-6X1KG
Lyzozyme	Sigma-Aldrich	62971-10G-F
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	746452-1KG
Methylecllulose	Sigma-Aldrich	8074844
MilliQ system (Integral 10)	Merck-Millipore		I-water dispenser
Mini protean TGX gels	BIORAD	4561086
NativeMark unstained protein standard	Invitrogen	LC0725	For iSCAT and Native gels
NativePAGE 4-16% GELS	Thermo Fisher scientific	BN1002BOX
NativePAGE Running Buffer kit	Thermo Fisher scientific	BN2007
Nikon Ti2-E	Nikon instruments		TIRF microscope
Nr. 1 Menzel coverslips	Thermo Fisher scientific	11961988
parafilm	Sigma-Aldrich	P7668
Plan Apo ×100/1.45 NA oil immersion objective	Nikon instruments		Confocal microscope
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)	SuSoS	CHF560.00
Poly-L-lysine solution 0.01%	Sigma-Aldrich	P4832	For iSCAT glass slides
Pottassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
Power supply for native gels	CONSORT	S/N 71638
POWERPAC UNIVERSAL	BIORAD	042BR31206
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oxygen scavenger – enzyme
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	03930590-50MG	oxygen scavenger – reagent
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110
Quemesa camera	Olympus		For Tecnai Spirit
Refeyn OneMP	Refeyn
Sample buffer, laemmli 2x concentrate	Sigma-Aldrich	S3401-10vl
Silicon gaskets	Sigma-Aldrich	GBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL	Thermo Fisher scientific	66381
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	PHR1441-1G
StrepTrap HP, 1 mL	GE healthcare	28-9075-46
Tecnai Spirit microscope	Thermo Scientific, FEI		TEM microscope Institute Curie
Terrific broth	Sigma-Aldrich	T0918-1KG
Tris/Glyine/SDS buffer	BIORAD	1610772
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941-1KG
Ultrasonic cleaner	Branson	CPX2800H-E
Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES	Sartorius	VS0622

Referencias

Mostowy, S., Cossart, P. Septins: The fourth component of the cytoskeleton. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 183-194 (2012).
Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3802 (2022).
Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. Septin form and function at the cell cortex. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17173-17180 (2015).
Smith, C., et al. Septin 9 exhibits polymorphic binding to F-actin and inhibits myosin and cofilin activity. Journal of Molecular Biology. 427 (20), 3273-3284 (2015).
Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
Marquardt, J., Chen, X., Bi, E. Architecture, remodeling, and functions of the septin cytoskeleton. Cytoskeleton. 76 (1), 7-14 (2018).
Van Ngo, H., Mostowy, S. Role of septins in microbial infection. Journal of Cell Science. 132 (9), (2019).
Fung, K. Y. Y., Dai, L., Trimble, W. S. Cell and molecular biology of septins. International Review of Cell and Molecular Biology. 310, 289-339 (2014).
Kinoshita, M., Field, C. M., Coughlin, M. L., Straight, A. F., Mitchison, T. J. Self- and actin-templated assembly of mammalian septins. Developmental Cell. 3 (6), 791-802 (2002).
Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers 2 with distinct SEPT9 isoforms. Journal of Cell Science. 134 (15), (2021).
Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
Kinoshita, M. Assembly of mammalian septins. Journal of Biochemistry. 134 (4), 491-496 (2003).
Connolly, D., et al. Septin 9 isoform expression, localization and epigenetic changes during human and mouse breast cancer progression. Breast Cancer Research. 13 (4), 76 (2011).
Connolly, D., et al. Septin 9 amplification and isoform-specific expression in peritumoral and tumor breast tissue. Biological Chemistry. 395 (2), 157-167 (2014).
Estey, M. P., Di Ciano-Oliveira, C., Froese, C. D., Bejide, M. T., Trimble, W. S. Distinct roles of septins in cytokinesis: SEPT9 mediates midbody abscission. Journal of Cell Biology. 191 (4), 741-749 (2010).
John, C. M., et al. The Caenorhabditis elegans septin complex is nonpolar. EMBO Journal. 26 (14), 3296-3307 (2007).
Field, C. M., et al. A purified Drosophila septin complex forms filaments and exhibits GTPase activity. Journal of Cell Biology. 133 (3), 605-616 (1996).
Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: Supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
Sellin, M. E., Sandblad, L., Stenmark, S., Gullberg, M. Deciphering the rules governing assembly order of mammalian septin complexes. Molecular Biology of the Cell. 22 (17), 3152-3164 (2011).
Akil, A., et al. Septin 9 induces lipid droplets growth by a phosphatidylinositol-5-phosphate and microtubule-dependent mechanism hijacked by HCV. Nature Communications. 7, 12203 (2016).
Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology. 19 (2), 140-145 (2009).
Omrane, M., et al. Septin 9 has two polybasic domains critical to septin filament assembly and Golgi integrity. iScience. 13, 138-153 (2019).
Carim, S. C., Kechad, A., Hickson, G. R. X. Animal cell cytokinesis: The rho-dependent actomyosin-anilloseptin contractile ring as a membrane microdomain gathering, compressing, and sorting machine. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575226 (2020).
El Amine, N., Kechad, A., Jananji, S., Hickson, G. R. X. Opposing actions of septins and Sticky on Anillin promote the transition from contractile to midbody ring. Journal of Cell Biology. 203 (3), 487-504 (2013).
Renshaw, M. J., Liu, J., Lavoie, B. D., Wilde, A. Anillin-dependent organization of septin filaments promotes intercellular bridge elongation and Chmp4B targeting to the abscission site. Open Biology. 4 (1), 130190 (2014).
Vogt, E. T., et al. The ultrastructural organization of actin and myosin II filaments in the contractile ring: new support for an old model of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 28 (5), 613-623 (2017).
Mavrakis, M., et al. Septins promote F-actin ring formation by crosslinking actin filaments into curved bundles. Nature Cell Biology. 16 (4), 322-334 (2014).
Karasmanis, E. P., et al. A septin double ring controls the spatiotemporal organization of the ESCRT machinery in cytokinetic abscission. Current Biology. 29 (13), 2174-2182 (2019).
Hagiwara, A., et al. Submembranous septins as relatively stable components of actin-based membrane skeleton. Cytoskeleton. 68 (9), 512-525 (2011).
Calvo, F., et al. Cdc42EP3/BORG2 and septin network enables mechano-transduction and the emergence of cancer-associated fibroblasts. Cell Reports. 13 (12), 2699-2714 (2015).
Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology. 31 (18), 4088-4103 (2021).
Kuzmić, M., et al. Septin-microtubule association via a motif unique to isoform 1 of septin 9 tunes stress fibers. Journal of Cell Science. 135 (1), (2022).
Shindo, A., et al. Septin-dependent remodeling of cortical microtubule drives cell reshaping during epithelial wound healing. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
Hu, Q., Nelson, W. J., Spiliotis, E. T. Forchlorfenuron alters mammalian septin assembly, organization, and dynamics. Journal of Biological Chemistry. 283 (43), 29563-29571 (2008).
Mavrakis, M., Tsai, F. C., Koenderink, G. H. Purification of recombinant human and Drosophila septin hexamers for TIRF assays of actin-septin filament assembly. Methods in Cell Biology. 136, 199-220 (2016).
Nakos, K., Radler, M. R., Spiliotis, E. T. Septin 2/6/7 complexes tune microtubule plus-end growth and EB1 binding in a concentration- and filament-dependent manner. Molecular Biology of the Cell. 30 (23), 2913-2928 (2019).
Kaplan, C., et al. Absolute arrangement of subunits in cytoskeletal septin filaments in cells measured by fluorescence microscopy. Nano Letters. 15 (6), 3859-3864 (2015).
Castro, D. K. S. V., et al. A complete compendium of crystal structures for the human SEPT3 subgroup reveals functional plasticity at a specific septin interface. IUCrJ. 7, 462-479 (2020).
Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -. C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 1-13 (2020).
Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10, 420 (2019).
Zhou, R., Shi, Y., Yang, G. Expression, purification, and enzymatic characterization of intramembrane proteases. Methods in Enzymology. 584, 127-155 (2017).
Diebold, M. L., Fribourg, S., Koch, M., Metzger, T., Romier, C. Deciphering correct strategies for multiprotein complex assembly by co-expression: Application to complexes as large as the histone octamer. Journal of Structural Biology. 175 (2), 178-188 (2011).
Lebedeva, M. A., Palmieri, E., Kukura, P., Fletcher, S. P. Emergence and rearrangement of dynamic supramolecular aggregates visualized by interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 14 (9), 11160-11168 (2020).
Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. Journal of Structural Biology. 128 (1), 82-97 (1999).
Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
Frank, J., et al. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. Journal of Structural Biology. 116 (1), 190-199 (1996).
Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 70, 301-322 (2019).
Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
Hernández-Rodríguez, Y., Momany, M. Posttranslational modifications and assembly of septin heteropolymers and higher-order structures. Current Opinion in Microbiology. 15 (6), 660-668 (2012).
Ribet, D., et al. SUMOylation of human septins is critical for septin filament bundling and cytokinesis. Journal of Cell Biology. 216 (12), 4041-4052 (2017).
Sinha, I., et al. Cyclin-dependent kinases control septin phosphorylation in Candida albicans hyphal development. Developmental Cell. 13 (3), 421-432 (2007).
Sheffield, P. J., et al. Borg/Septin interactions and the assembly of mammalian septin heterodimers, trimers, and filaments. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3483-3488 (2003).
Joberty, G., et al. Borg proteins control septin organization and are negatively regulated by Cdc42. Nature Cell Biology. 3 (10), 861-866 (2001).
Chen, X., Wang, K., Svitkina, T., Bi, E. Critical roles of a RhoGEF-anillin module in septin architectural remodeling during cytokinesis. Current Biology. 30 (8), 1477-1490 (2020).
Kučera, O., et al. Anillin propels myosin-independent constriction of actin rings. Nature Communications. 12 (1), 1-12 (2021).
Hsu, S. C., et al. Subunit composition, protein interactions, and structures of the mammalian brain sec6/8 complex and septin filaments. Neuron. 20 (6), 1111-1122 (1998).
Olivi, L., et al. Towards a synthetic cell cycle. Nature Communications. 12 (1), 1-11 (2021).
Hürtgen, D., Härtel, T., Murray, S. M., Sourjik, V., Schwille, P. Functional modules of minimal cell division for synthetic biology. Advanced Biosystems. 3 (6), 1800315 (2019).
Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: Reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. The Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
Lobato-Márquez, D., Mostowy, S. Septins recognize micron-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Castro-Linares, G., den Haan, J., Iv, F., Silva Martins, C., Bertin, A., Mavrakis, M., Koenderink, G. H. Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution. J. Vis. Exp. (184), e63871, doi:10.3791/63871 (2022).