Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Gerard Castro-Linares; Jeffrey den Haan; Francois Iv; Carla Silva Martins; Aur&#233;lie Bertin; Manos Mavrakis; Gijsje H. Koenderink

doi:10.3791/63871

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Bioquímica

Reinigung und Qualitätskontrolle von rekombinanten Septinkomplexen zur zellfreien Rekonstitution

Published: June 23, 2022

doi:

10.3791/63871

Gerard Castro-Linares¹, Jeffrey den Haan¹, Francois Iv², Carla Silva Martins², Aurélie Bertin³, Manos Mavrakis², Gijsje H. Koenderink¹

¹Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology, ²Institut Fresnel, CNRS UMR7249,Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, ³Institut Curie, Université PSL,Sorbonne Université

Summary

Die In-vitro-Rekonstitution von Zytoskelettproteinen ist ein wichtiges Werkzeug, um die grundlegenden funktionellen Eigenschaften dieser Proteine zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Reinigung und Bewertung der Qualität von rekombinanten Septinkomplexen, die eine zentrale Rolle bei der Zellteilung und -migration spielen.

Abstract

Septine sind eine Familie konservierter eukaryotischer GTP-bindender Proteine, die Zytoskelettfilamente und Strukturen höherer Ordnung aus hetero-oligomeren Komplexen bilden können. Sie interagieren mit anderen Zytoskelettkomponenten und der Zellmembran, um an wichtigen zellulären Funktionen wie Migration und Zellteilung teilzunehmen. Aufgrund der Komplexität der vielen Interaktionen von Septinen, der großen Anzahl von Septin-Genen (13 beim Menschen) und der Fähigkeit von Septinen, hetero-oligomere Komplexe mit unterschiedlichen Untereinheitenzusammensetzungen zu bilden, ist die zellfreie Rekonstitution eine wichtige Strategie, um die Grundlagen der Septinbiologie zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt zunächst ein Verfahren zur Reinigung rekombinanter Septine in ihrer hetero-oligomeren Form unter Verwendung eines zweistufigen Affinitätschromatographie-Ansatzes. Dann wird der Prozess der Qualitätskontrolle zur Überprüfung der Reinheit und Integrität der Septinkomplexe detailliert beschrieben. Dieses Verfahren kombiniert native und denaturierende Gelelektrophorese, negative Färbeelektronenmikroskopie und interferometrische Streumikroskopie. Abschließend wird eine Beschreibung des Verfahrens zur Überprüfung der Polymerisationsfähigkeit von Septinkomplexen mittels negativer Färbeelektronenmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie gegeben. Dies zeigt, dass es möglich ist, hochwertige humane Septin-Hexamer und -Oktamere herzustellen, die verschiedene Isoformen von septin_9 enthalten, sowie Drosophila-Septin-Hexamer .

Introduction

Das Zytoskelett wurde klassischerweise als Dreikomponentensystem beschrieben, das aus Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Zwischenfilamenten^besteht 1, aber kürzlich wurden Septine als vierte Komponente des Zytoskeletts¹ anerkannt. Septine sind eine Familie von GTP-bindenden Proteinen, die in Eukaryoten² konserviert sind. Septine sind an vielen zellulären Funktionen wie Zellteilung³, Zell-Zell-Adhäsion⁴, Zellmotilität⁵, Morphogenese⁶, zelluläre Infektion⁷ und der Herstellung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität⁸ beteiligt. Trotz ihrer wichtigen Funktionen ist wenig verstanden, wie Septine an solchen Prozessen beteiligt sind.

Die Septin-Proteinfamilie wird in mehrere Untergruppen (vier oder sieben, je nach Klassifizierung) unterteilt, basierend auf der Proteinsequenzähnlichkeit². Mitglieder verschiedener Unterfamilien können palindromische hetero-oligomere Komplexe bilden, die die Bausteine von Filamenten sind und die sich wiederum zu Strukturen höherer Ordnung wie Bündeln, Ringen und Netzen zusammenfügen 1,9,10,11,12. Eine weitere molekulare Komplexität ergibt sich aus dem Vorhandensein verschiedener Spleißvarianten, ein Beispiel ist humanes SEPT9, wo es Hinweise auf spezifische Funktionen verschiedener Spleißvarianten^13,14,15 gibt. Darüber hinaus hängt die Länge der Hetero-Oligomere von Spezies und Zelltyp ab. Zum Beispiel bilden Caenorhabditis elegans Septine Tetramere 16, Drosophila melanogaster Septine bilden Hexamer 17 (Abbildung 1A), Saccharomyces cerevisiae Septine bilden Oktamere 18 und menschliche Septine bilden sowohl Hexamer als auch Oktamere¹⁹ (Abbildung ^1A). Die Fähigkeit von Septinisoformen, Spleißvarianten und posttranslational modifizierten Septinen derselben Unterfamilie, sich im Komplex gegenseitig zu substituieren, und die (Ko-)Existenz unterschiedlich großer Hetero-Oligomere haben es schwierig gemacht, die zellulären Funktionen verschiedener hetero-oligomerer Komplexe abzugrenzen¹².

Eine weitere interessante Fähigkeit von Septinen ist ihre Fähigkeit, mit vielen Bindungspartnern in der Zelle zu interagieren. Septine binden die Plasmamembran und die membranösen Organellen während der Interphase und Zellteilung^20,21,22. In sich teilenden Zellen kooperieren Septine mit Anillin 23,24,25 und Aktin und Myosin während der Zytokinese ^26,27. In den späten Stadien der Zytokinese scheinen Septine die endosomalen Sortierkomplexe zu regulieren, die für das Transportsystem (ESCRT) für die Mittelkörperabscission erforderlich^{sind 28}. Darüber hinaus gibt es auch Hinweise auf Septin auf dem Aktinkortex und Aktin-Stressfasern von Zellen in Interphase-Zellen 29,30,31. In bestimmten Zelltypen binden und regulieren Septine auch das Mikrotubuli-Zytoskelett^32,33.

All diese Eigenschaften machen Septine zu einem sehr interessanten, aber auch herausfordernden Proteinsystem. Die Kombination der großen Anzahl von Septin-Untereinheiten (13 Gene beim Menschen ohne Spleißvarianten²) mit dem Potenzial von Septin-Untereinheiten aus derselben Unterfamilie, sich gegenseitig zu substituieren und unterschiedlich große Hetero-Oligomere zu bilden, macht es schwierig, durch genetische Manipulation einen Rückschluss auf die zelluläre Funktion eines bestimmten Septins zu ziehen. Darüber hinaus machen die vielfältigen Wechselwirkungen von Septinen die Interpretation der Wirkungen gängiger Forschungsinstrumente wie Medikamente³⁴ , die auf Zytoskelett- oder Membrankomponenten gerichtet sind, zu einer schwierigen Aufgabe.

Eine Möglichkeit, diese Situation zu überwinden, besteht darin, die Forschung an Zellen durch eine in vitro (zellfreie) Rekonstitution von Septinen zu ergänzen. Die In-vitro-Rekonstitution ermöglicht die Isolierung eines einzigen Typs von Septin-Hetero-Oligomeren mit einer spezifischen Untereinheitszusammensetzung und Länge 18,35,36,37. Dieser Komplex kann dann in einer kontrollierten Umgebung untersucht werden, entweder allein, um die grundlegenden strukturellen und physikochemischen Eigenschaften der Septine 38,39,40 zu entdecken, oder in Kombination mit gewünschten Partnern wie Modellbiomembranen ^11,41,42, Aktinfilamenten ^10,27 oder Mikrotubuli ^32,36, um die Natur ihrer wechselwirkungen.

Daher ist eine zuverlässige Methode zur effizienten Reinigung verschiedener Septinkomplexe für die Septinforschung von entscheidender Bedeutung. Selbst bei Verwendung desselben Protokolls können jedoch unterschiedliche Reinigungsvorgänge Proteine mit unterschiedlicher Aktivität / Funktionalität oder sogar Integrität ergeben. Für kommerziell erhältliche Proteine wie Enzyme werden die Funktionalität und die enzymatische Aktivität sorgfältig validiert⁴³. Die Implementierung einer sorgfältigen Qualitätskontrolle für Zytoskelett- oder Strukturproteine wie Septine kann eine Herausforderung darstellen, aber es ist wichtig, Experimente über Labore hinweg vergleichbar zu machen.

Dieser Artikel beschreibt eine robuste Methode zur Reinigung hochwertiger rekombinanter Septine in ihrer hetero-oligomeren Form, die auf der gleichzeitigen Expression von zwei Vektoren basiert, die mono- oder bi-cistronische Konstrukte (Tabelle 1) in Escherichia coli-Zellen enthalten. Die Methode besteht aus einem zweistufigen Affinitätschromatographie-Ansatz zur Erfassung von Septin-Hetero-Oligomeren, die sowohl ein his 6-markiertes Septin als auch ein Strep-II-markiertes Septin enthalten (Abbildung 1B, C). Dieses Protokoll, das erstmals in Iv et al.10 beschrieben wurde, wurde verwendet, um Drosophila septin hexamers 11,27,35, human septin hexamers 10 und mehrere humane septin octamere zu reinigen, die verschiedene native (Isoform 1, 3 und 5) ^10,32 oder mutierte SEPT9-Isoformen enthalten ³² . Darüber hinaus wird eine Reihe von Techniken zur Beurteilung der Qualität der gereinigten Septine beschrieben. Zunächst wird die Integrität und korrekte Stöchiometrie der Septin-Untereinheiten mittels Denaturierungselektrophorese und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft. Dann werden das Vorhandensein von Hetero-Oligomeren der richtigen Molekülmasse und das Vorhandensein von Monomeren oder kleineren Oligomeren, die auf eine komplexe Instabilität hinweisen, durch native Elektrophorese und Massenphotometrie mittels interferometrischer Streumikroskopie (iSCAT) untersucht. Der letzte Schritt besteht schließlich in der Beurteilung der Polymerisationsaktivität der Septine mittels Fluoreszenzmikroskopie und TEM.

Abbildung 1: Reinigungsstrategie . (A) Schematische Darstellung der Septin-Hetero-Oligomere, die in menschlichen (links) und Drosophila-Zellen (rechts) vorkommen. Zahlen bezeichnen Septin-Untereinheiten aus den angegebenen Gruppen und P bedeutet Erdnuss. Humanes SEPT9 kann jede seiner Isoformen sein. Die Septin-Untereinheiten haben eine asymmetrische Form und sind längs mit zwei verschiedenen Grenzflächen verbunden, der NC:NC- und der G:G-Schnittstelle, wie mit NC bzw. G auf dem menschlichen Hexamer bezeichnet. (B,C) Schematische Darstellung der zweistufigen Chromatographiestrategie, dargestellt für (B) menschliche Septin-Hexamer und (C) Oktomere. H zeigt die his-Tags an, während S die Strep-II-Tags angibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. Reinigung von Septin-Hetero-Oligomeren Co-Transformation von Bakterienzellen mit den ExpressionsvektorenWählen Sie eine Kombination aus einem pnEA und einem pnCS-Plasmid44, die für den Ausdruck verwendet werden soll. Wählen Sie die Kombination in Abhängigkeit von der gewünschten Untereinheitszusammensetzung des Septin-Hetero-Oligomers10,35 und davon, ob eine fluoreszierende Markierung erforderlich ist oder nicht.HINWEIS: C-terminally tagged monomeric superfolder GFP (msfGFP)-tagged SEPT2 (für humane Septine) oder msfGFP- oder monomeric enhanced GFP (mEGFP)-DSep2 (für Drosophila septins) wird hier verwendet (Tabelle 1). 1 μL jedes Plasmids (~1 ng/μL) in 100 μL kompetente BL21 Escherichia coli-Zellen pipettieren und 20 min auf Eis inkubieren. Die Zellen für 40 s in ein Wasserbad bei 42 °C geben und dann sofort für 3 min auf Eis inkubieren. 0,9 ml Lysogeniebrühe (LB) medium in die Zellsuspension geben und die Zellen 1 h bei 37 °C wachsen lassen. Platte 100 μL Zellen auf warmen LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin und 100 μg/ml Spectinomycin und Inkubation über Nacht bei 37 °C. Bakterielle Vorkultur anbauenFüllen Sie einen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Terrific Bouillon (TB) oder LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin und 100 μg/ml Spectinomycin enthält. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der LB-Agarplatte mit einer sterilen Impfschlaufe aus und übertragen Sie sie auf frische Medien aus Schritt 1.2.1. Bei 37 °C in einem Rotationsschüttler-Inkubator entweder über Nacht oder für mindestens 6 h inkubieren.HINWEIS: Aus dieser Kultur kann eine Glycerinbrühe hergestellt werden, indem die Bakteriensuspension 1:1 mit Glycerin gemischt und bei −80 °C gelagert wird. Dieser Bestand kann in Schritt 1.2.2 verwendet werden. statt einer frisch verwandelten Kolonie. Induktion von Bakterienkultur und Proteinexpression100 ml gezüchtete Bakterien werden in 5 l TB oder LB mit 50 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Spectinomycin überführt. Diese Kultur wird bei 37 °C in einem Shaker-Inkubator gezüchtet, bis sie eine optische Dichte (OD) erreicht, die bei einer Wellenlänge von 600 nm im Bereich von 2-3 für unmarkierte Septine oder 0,6-0,8 für msfGFP/mEGFP-markierte Septine gemessen wird, und Proteinexpression durch Zugabe einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG induzieren. Der niedrigere OD für die markierten Septine besteht darin, das Erreichen der Todesphase in ihrer längeren Expressionszeit zu vermeiden, wie im nächsten Schritt beschrieben. Inkubieren Sie die Zellen, die unmarkierte Septin-Hetero-Oligomere exprimieren, für 3 h bei 37 °C oder die Zellen, die msfGFP-markierte Hetero-Oligomere exprimieren, über Nacht bei 17 °C.HINWEIS: Die kurze Proteinexpressionszeit für nicht markierte Komplexe, die durch die Verwendung des reichhaltigeren TB-Mediums erleichtert wird, wird gewählt, um den Proteinabbau zu verhindern. Die längere Expressionszeit in Kombination mit einer niedrigeren Temperatur für markierte Komplexe wird gewählt, um eine korrekte Faltung des msfGFP-Tags zu ermöglichen. Bakterielle Lyse und LysatklärungHINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt des Reinigungsverfahrens sollte die proteinhaltige Lösung immer auf Eis oder bei 4 °C aufbewahrt werden, um einen proteolytischen Proteinabbau oder Aktivitätsverlust zu verhindern.Die kultivierten Zellen werden durch Zentrifugieren bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C gesammelt. Verwerfen Sie den Überstand.Optional wird das Pellet in diesem Schritt eingefroren und bei −80 °C für maximal 6 Monate gelagert. Wenn diese Option gewählt wird, stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet auf Eis auftauen, bevor Sie fortfahren. Das Pellet wird in 100 ml Lysepuffer (Tabelle 2) gelöst und die Zellen lysiert. Wählen Sie eine der beiden folgenden OptionenBeschallen Sie in 7 Zyklen von 30 s EIN und 59 s AUS mit einem Spitzenbeschaller mit 30% Amplitude (beachten Sie, dass die Einstellungen beschallungsabhängig sind). Zerlegen Sie die Zellen in der französischen Presse, indem Sie sie mindestens 3x passieren. Das Zelllysat durch Zentrifugieren bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C klären und den Überstand beibehalten. Es wird empfohlen, mit Schritt 1.5.1 zu beginnen. während dieses Zentrifugalschritts. Optional wird eine Probe zur Denaturierung der Elektrophorese entnommen, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Affinitätschromatographie für His-markierte ProteineHINWEIS: Dieser Schritt ergibt Komplexe, die humanes SEPT2 oder Drosophila Sep1 unter Verwendung einer Nickelsäule enthalten (Abbildung 1B).Equilibrieren Sie eine vorverpackte Nickelsepharose-Hochleistungschromatographie-Säule mit Septinpuffer (Tabelle 2). Laden Sie den geklärten Überstand mit 1 ml/min auf die Säule und waschen Sie das gebundene Protein mit mindestens drei Säulenvolumina Septinpuffer. Eluieren Sie die Septinkomplexe mit 50% HisTrap-Elutionspuffer (Tabelle 2) bei 1 ml/min und sammeln Sie dabei 0,5 ml Fraktionen, um eine Imidazolkonzentration von 250 mM zu erhalten. Wählen Sie die Fraktionen, die Septinkomplexe enthalten, wie durch die optische Absorption des Eluats bei 280 nm angezeigt, die online mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem (FPLC) oder nach der Reinigung mit einem Mikrovolumenspektralphotometer überwacht wird.HINWEIS: Imidazol absorbiert Licht bei 280 nm. Dies erklärt wahrscheinlich, warum der Proteinpeak nach der Septin-Elution nicht wieder auf Null zurückgeht (Abbildung 2A). Affinitätschromatographie für Strep-II-markierte ProteineHINWEIS: Dieser Schritt ergibt Komplexe, die entweder humanes SEPT7 (Hexamer), humanes SEPT9 (Oktamere) oder Drosophila-Erdnuss unter Verwendung einer Streptokokken-Tactin-Säule enthalten (Abbildung 1B). Die Chromatographie-Säule basiert auf einem modifizierten Biotin-Streptavidin-System. Das Protein ist mit modifiziertem Biotin (Strep-II-Tag) markiert, und die Säule enthält ein technisch hergestelltes Streptavidin (Strep-Tactin). Trotz der Modifikation des Biotin-Streptavidin-Systems gibt es keine Interferenz zwischen dem Strep-Tactin-Strep-II-Tag-System und dem Biotin-Streptavidin-System. Das beschriebene System wird verwendet, um Interferenzen mit Rekonstitutionsassays unter Verwendung von Biotin und Streptavidin zu vermeiden.Equilibrieren Sie eine vorverpackte StrepTactin-Sepharose-Hochleistungschromatographie-Säule mit Septinpuffer (Tabelle 2). Laden Sie die septinhaltigen Fraktionen, die aus der Nickelsäule gewonnen werden, mit 1 ml/min und waschen Sie das gebundene Protein mit mindestens drei Säulenvolumina Septinpuffer. Eluieren Sie die Septinkomplexe mit 100% StrepTrap-Elutionspuffer (Tabelle 2) bei 1 ml/min und sammeln Sie 0,5 ml Fraktionen, um eine Konzentration von 2,5 mM Desthiobiotin zu erhalten.HINWEIS: Das Desthiobiotin im StrepTrap-Elutionspuffer muss frisch gelöst werden. Wählen Sie die Fraktionen, die Septinkomplexe enthalten, wie durch die optische Absorption des Eluats bei 280 nm angezeigt, die online mit einem FPLC-System oder nach der Reinigung mit einem Mikrovolumenspektralphotometer überwacht wird.HINWEIS: Die Denaturierungselektrophorese wird an dieser Stelle normalerweise mit Proben der Säulenwaschungen und Septinfraktionen durchgeführt. Die Reihenfolge der Spalten kann mit nicht unterscheidbaren Ergebnissen invertiert werden, d.h. das geklärte Lysat nach Schritt 1.4. kann einer Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gefolgt von einer Nickelaffinitätschromatographie unterzogen werden. Dialyse und LagerungUm das Desthiobiotin aus der endgültigen Speicherlösung zu entfernen, dialysieren Sie die Septinkomplexe in einem ~1:300 Proben-zu-Puffer-Volumenverhältnis gegen Septinpuffer (Tabelle 2), ergänzt mit 1 mM DTT über Nacht oder für mindestens 4 h bei 4 °C unter Verwendung einer 30 kDa MWCO-Dialysemembran. Gegebenenfalls werden die Septine mit einer 30 kDa MWCO Zentrifugalkonzentrationssäule bis zur gewünschten Konzentration konzentriert. Streben Sie eine Konzentration von 5-7 μM an, gemessen mit der optischen Absorption der Lösung bei 280 nm und unter Verwendung eines theoretischen Extinktionskoeffizienten, der mit ProtParam berechnet wurde (Tabelle 3). Aliquot die Proteinkomplexe in die gewünschte aliquote Größe, das Aliquot einfrieren und bei −80 °C lagern.HINWEIS: Es wird empfohlen, das Protein nicht länger als 6 Monate zu lagern. Darüber hinaus wird empfohlen, regelmäßige Qualitätskontrollexperimente durchzuführen, insbesondere wenn das Protein länger als die empfohlene Zeit gelagert wird. 2. Qualitätskontrolle der Reinheit und Integrität des Septin-Hetero-Oligomers HINWEIS: Die Hetero-Oligomer-Qualitätskontrolle besteht aus einer Reihe von biochemischen und bildgebenden Verfahren, die den Nachweis der Masse und Integrität der in der Lösung vorhandenen Septinkomplexe ermöglichen. Denaturierungselektrophorese zur Überprüfung der Bildung des Septin-Hetero-Oligomers mit den richtigen KomponentenMischen Sie 10 μL der ausgewählten Fraktionen mit 10 μL 2x SDS-Probenpuffer, laden Sie sie auf ein vorgefertigtes 4%-15% TGX-Gel und füllen Sie das System mit Tris/Glycin/SDS-Laufpuffer. Führen Sie die Elektrophorese für 35 Minuten bei 200 V durch und färben Sie das Gel (Table of Materials), um die Ergebnisse zu visualisieren. Die Molekulargewichte der einzelnen Septinproteine und Septin-Hetero-oligomeren Komplexe sind Tabelle 3 zu entnehmen. Messen Sie die relative Intensität jedes Bandes innerhalb jeder Spur, das gereinigte Septine enthält, in einem kontrastinvertierten Bild. Berechnen Sie dazu die mittlere Intensität von gleich großen Rechtecken um jedes Band und eines gleich großen Rechtecks in einem Bereich ohne Band in derselben Spur. Normalisieren Sie dann die Werte, indem Sie die Intensität jedes Bandes durch die Intensität des Bereichs ohne Bänder dividieren.HINWEIS: Wenn die Intensität gesättigt ist (z. B. Werte von 255 für ein 8-Bit-Bild in einem kontrastinvertierten Bild), überspringen Sie die Spur. Ensemble-gemittelte native Größenverteilung durch native ElektrophoreseBereiten Sie am Vortag 800 mL Anodenpuffer und 200 mL hellblauen Kathodenpuffer vor und bewahren Sie sie im Kühlschrank auf. Um den Anodenpuffer vorzubereiten, verdünnen Sie 40 ml 20x Laufpuffer mit 760 ml deionisiertem Wasser Typ I (I-Wasser). Zur Herstellung des hellblauen Kathodenpuffers werden 10 ml 20x Laufpuffer und 1 ml 20x Kathodenadditiv mit 189 mL I-Wasser verdünnt. Der laufende Puffer und das Kathodenadditiv werden mit einem Kit (Table of Materials) geliefert. Bereiten Sie 10 μL der Probe vor, indem Sie ~500 ng Septin mit der erforderlichen Menge Probenpuffer (in diesem Fall 2,5 μL, aufgrund der Verwendung eines 4x-Probenpuffers; siehe Materialtabelle) und genügend I-Wasser mischen, um ein Volumen von 10 μL zu erreichen. Laden Sie die Proben auf das Gel und füllen Sie das System mit den eiskalten Anoden- und Kathodenpuffern. Führen Sie die Elektrophorese für ca. 115 min bei 150 V mit einer Stromversorgung aus, die bei niedrigen Strömen nicht stoppt, und färben Sie das Gel (Table of Materials), um die Ergebnisse zu visualisieren. Die anhand der Sequenz berechneten Molekulargewichte der einzelnen Proteine und Komplexe sind in Tabelle 3 zu finden. Einzelmolekül-Massenverteilung mittels Massenphotometrie mittels interferometrischer StreumikroskopieWaschen Sie # 1.5 Glasobjektträger, indem Sie sie in einem Ultraschallreiniger für 5 Minuten in I-Wasser, 5 Minuten in Isopropanol und schließlich 5 Minuten in I-Wasser beschallen. Trocknen Sie zwei Glasobjektträger mit einem sanften Stickstoffgasstrom und legen Sie einen 7 μL Tropfen 0,01% Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung auf die Mitte eines der Objektträger. Platzieren Sie dann die Mitte des anderen Objektträgers auf dem PLL-Tropfen und richten Sie die beiden Objektträger orthogonal aus, um eine einfache Trennung zu ermöglichen. Inkubieren für 30 s.Waschen, indem Sie 1x mit I-Wasser in ein Becherglas tauchen und 2x direkt einen Strom I-Wasser auftragen. Dann trocknen Sie die beiden Objektträger mit einem Strom von Stickstoffgas. Diese Objektträger können anschließend ca. 6 Wochen bei Raumtemperatur trocken gelagert werden.Hinweis: Beschriften Sie die Seite des Objektträgers, die mit der PLL behandelt wird, um das Experiment korrekt auszuführen. Schneiden Sie kurz vor dem Experiment ein Stück von 2 x 2, 3 x 2 oder 3 x 3 Dichtungen (die 4, 6 bzw. 9 Bildkammern / Objektträger ergeben) und kleben Sie es auf den PLL-behandelten Teil eines Objektträgers, während Sie vermeiden, dass der Objektträger und die Dichtungen mit einer schmutzigen Oberfläche in Kontakt kommen. Legen Sie den Objektträger auf ein leichtes Wischertuch und drücken Sie mit einer Pipettenspitze auf die Dichtungen, um sie mit dem schützenden Kunststoff noch auf die Dichtungen zu kleben. Septinpuffer (Tabelle 2) auf Raumtemperatur erwärmen und die Proteine in der Hand auftauen (danach auf Eis halten).HINWEIS: iSCAT zeigt das Signal einiger Reinigungsmittel und kleiner Moleküle, die Proteinsignalenähneln 45. DTT ist eines dieser kleinen Moleküle, und deshalb wird es nicht für dieses Experiment verwendet. Es gibt nur eine Spur von DVB-T, die aus dem gelagerten Septin kommt. Legen Sie den Objektträger mit Dichtungen auf das handelsübliche Massenphotometriesystem, das 19 μL Septinpuffer enthält, und fokussieren Sie das Mikroskop mit der Autofokus-Option. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um zu überprüfen, ob der gefundene Fokus korrekt ist. Hier wird das Standard-100x-Objektiv verwendet, das Teil des Setups ist. Erstellen oder laden Sie einen Projektordner, um die Daten mit Datei > Neues Projekt oder Datei > Projekt laden zu speichern. Pipettieren Sie 1 μL Probe auf die 19 μL Septinpuffertropfen (Schritt 2.3.5), die zum Fokussieren und Mischen verwendet wird, während die Bewegung des Objektträgers minimiert wird, indem dabei nichts berührt wird. Nehmen Sie dann ein Video mit 6.000 Bildern auf, indem Sie auf Aufnahme klicken.Für eine korrekte Analyse notieren Sie die folgenden Proben: Septinpuffer, Proteinmassenstandard für die Kalibrierung des Signal-Masse-Verhältnisses (wenn eine aktuelle Kalibrierung verfügbar ist und sich die Umgebungsbedingungen nicht geändert haben, kann diese Probe übersprungen werden) und 250 nM Septinkomplexe, verdünnt in Septinpuffer ohne DVB-T (dies ergibt eine Endkonzentration von ~ 12,5 nM). Analysieren Sie die Videos mit der Software des Herstellers, um die Proteinmassenverteilung zu erhalten. Überprüfen Sie wie folgt auf qualitativ hochwertige Daten.Wenn sich die Peaks verschiedener Septin-Hetero-Oligomere-Größen zu stark überlappen oder zu viele Ereignisse erkannt werden (>3.500 Ereignisse für ein 6.000-Frames-Video mit dem regulären Sichtfeld von 128 Pixel x 34 Pixeln über 10,8 μm x 2,9 μm), verringern Sie die endgültige Septinkonzentration und messen Sie erneut. Wenn nicht genügend einzelne Moleküle gemessen werden (mindestens 2.500-3.500 für ein 6.000-Frame-Video mit dem regulären Sichtfeld), erhöhen Sie die Septinkonzentration und messen Sie erneut. Direkte Abbildung von Septinkomplexen mittels Elektronenmikroskopie mit negativer FärbungstransmissionDie Proben werden in einem Septinpuffer auf eine Konzentration von etwa 50 nM verdünnt und die Färbelösung (2% Uranylformiat oder Uranylacetat in I-Wasser) vorbereitet.HINWEIS: Uranylformiat muss frisch zubereitet werden. 4 μL verdünnte Septine werden auf ein glühend entladenes Elektronenmikroskopiegitter pipettiert und 30 s inkubiert. Entfernen Sie den größten Teil der Proteinlösung mit einem Filterpapier und waschen Sie das Gitter 2x mit Septinpuffer und 1x mit I-Wasser, um lose adsorbierte Septine zu entfernen. Mit 2% Uranylacetat oder Uranylformiatlösung in I-Wasser für 1 min färben, die Färbelösung mit einem Filterpapier absorbieren und das Gitter einige Minuten an der Luft trocknen. Screenen Sie das Gitter mit einem richtig ausgerichteten Transmissionselektronenmikroskop, um nach Regionen mit verstärkter Färbung zu suchen und etwa 100 Bilder innerhalb dieser ausgewählten Bereiche zu sammeln. Nehmen Sie Bilder mit einer Vergrößerung von mindestens 50.000x auf, um eine Pixelgröße von etwa 2 Å / Pixel und mit einer Unschärfe von -1 μm bis -2 μm zu erhalten. Verwenden Sie eine Beschleunigungsspannung von 200 kV. Verwenden Sie vorzugsweise ein automatisiertes Verfahren zur Erfassung der Daten, das von der verfügbaren Erfassungssoftware abhängt. Führen Sie 2D-Bildverarbeitung mit spezieller Software durchBoxen Sie mindestens 2.000 Partikel mit einer speziellen Softwareaus 46. Führen Sie die zweidimensionale Ausrichtung und Klassifizierung iterativ durch, bis Klassen ohne weitere Verbesserungen erhalten werden. Der erste Ausrichtungs- und Klassifizierungsschritt sollte referenzfrei sein, um Verzerrungen in der Klassifizierung zu vermeiden. Verwenden Sie die Durchschnittswerte aus der ersten referenzfreien Klassifikation als neue Referenzen, um eine zusätzliche Klassifizierungsrunde durchzuführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang iterativ, bis keine weitere Verbesserung erreicht wird. Stellen Sie sicher, dass jede Klasse auf 50 bis 100 gepflückten Partikeln basiert und einzelne Untereinheiten deutlich sichtbar sind. Es können verschiedene Software-Tools verwendet werden (Spider, Eman oder Relion)46,47,48. 3. Septin funktionelle Qualitätskontrolle durch Polymerisationsanalyse HINWEIS: Die Qualitätskontrolle der Funktionalität besteht aus einer Reihe von bildgebenden Verfahren, die den Nachweis von polymerisierten Septinkomplexen ermöglichen. Im Folgenden werden unmarkierte Septine als “dunkle” Septine bezeichnet, und der Puffer, der zum Polymerisieren von unmarkierten Septinen verwendet wird, wird als “dunkler” Septinpolymerisationspuffer (SPB) bezeichnet. Septin-Bündel-Bildgebung mittels FluoreszenzmikroskopieBereiten Sie das 5x fluoSPB (Tabelle 2) und eine Septinmischung bestehend aus 90% dunklem Septin und 10% msfGFP-Septin in sechsmal höherer Konzentration als die gewünschte Endkonzentration in Septinpuffer + 1 mM DTT vor. Eine typische Konzentration für diesen Assay beträgt 300 nM und daher beträgt die Konzentration 1.800 nM für diese Mischung. Polymerisieren Sie das Septin, indem Sie in dieser spezifischen Reihenfolge I-Wasser (genug, um das gewünschte Endvolumen aufzufüllen), 20% 5xfluoSPB (eine endgültige Verdünnung von 1:5), 0,05 μM PCD und 16,67% Septinmischung (eine endgültige Verdünnung von 1:6) mischen. Für 10 μL mischen Sie 6,23 μL I-Wasser, 2 μL 5xfluoSPB, 0,1 μL PCD (mit einem Vorrat von 5 μM) und 1,67 μL Septinmischung. Diese Mischung für mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Proben werden in eine mit fluoSPB gewaschene Bildkammer gegeben (Tabelle 2) und die Septinbündel abgebildet. PLL-PEG-passivierte Strömungskanäle, wie in früheren Forschungen 10,32 beschrieben, funktionieren gut für dieses Experiment. Septin-Bündel-Imaging mittels negativer FärbetransmissionselektronenmikroskopieBereiten Sie das 5x darkSPB (Tabelle 2) und eine Septinmischung bestehend aus 100% dunklem Septin in sechsmal höherer Konzentration als die gewünschte Endkonzentration in Septinpuffer + 1 mM DTT vor. Eine typische Konzentration für diesen Assay beträgt 300 nM und daher beträgt die Konzentration 1.800 nM für diese Mischung. Polymerisieren Sie die Septinkomplexe durch Mischen von I-Wasser (genug, um das gewünschte Endvolumen aufzufüllen), 20% 5xdarkSPB und 16,67% Septinmischung. Für 5 μL mischen Sie 3,16 μL I-Wasser, 1 μL 5x darkSPB und 0,83 μL Septinmischung. Diese Mischung für mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. 3-5 μL Probe in ein Glimmentladungs-Elektronenmikroskopiegitter geben und 1 min inkubieren. Dann waschen Sie das Gitter 2x mit darkSPB (Tabelle 2), indem Sie die Flüssigkeit mit einem Filterpapier absorbieren und einen Tropfen darkSPB-Puffer hinzufügen, 1x mit I-Wasser waschen, ~ 30 s mit 2% Uranylacetat inkubieren, den Fleck abtupfen und die Probe einige Minuten an der Luft trocknen. Stellen Sie die Septinbündel bei 120 kV und Vergrößerungen zwischen 5.000x und 60.000x mit einer Unschärfe zwischen 1-2 μm dar.

Representative Results

Wie im Protokoll erwähnt, wurden 5 L E. coli-Zellen , die mit den beiden Septin-exprimierenden Plasmiden kotransformiert waren, gezüchtet, und die Expression von Septinen wurde durch Zugabe von IPTG induziert. Nach 3 h wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, im Lysepuffer resuspendiert und durch Beschallung lysiert. Das Lysat wurde dann durch Zentrifugation geklärt, und die geklärte Lösung wurde auf eine HisTrap-Säule aufgetragen (Abbildung 2A). Nach der ersten Reinigung wurden die septinhaltigen Fraktionen gepoolt und auf eine StrepTrap-Säule aufgetragen (Abbildung 2B). Dies ergibt typischerweise etwa 3-5 mL ~1 μM Septinkomplex. Vor dem Pooling der septinhaltigen Fraktionen kann die Denaturierungsgelelektrophorese verwendet werden, um die Integrität der Septin-Untereinheiten und das äquimolare stöchiometrische Verhältnis zwischen den verschiedenen Septin-Untereinheiten, die den Komplex bilden, zu überprüfen. (Abbildung 3A). Wenn das Gel ähnlich intensive Banden aufweist, die den Molekulargewichten (Tabelle 3) der Septin-Untereinheiten entsprechen, kann das Protokoll fortgesetzt werden. Wenn nicht, wird empfohlen, das Protokoll erneut zu starten. In dem gezeigten Beispiel für humanes Septinoktamer mit SEPT9_i1 zeigt Abbildung 3A deutlich Banden, die SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 und SEPT2 (in der Reihenfolge von oben nach unten) mit ähnlichen Intensitäten entsprechen; Das 99%-Konfidenzintervall der normalisierten Intensität betrug 1,128 ± 0,048 für SEPT2, 1,092 ± 0,034 für SEPT6, 1,108 ± 0,040 für SEPT7 und 1,067 ± 0,029 für SEPT9. Wenn SEPT2 mit msfGFP markiert ist, verschiebt es sich sehr nahe unter SEPT9_i1. Abhängig vom verwendeten Elektrophoresesystem und dem Vorhandensein des C-terminalen TEV-Strep-Tags für SEPT7 (wodurch es langsamer migriert als unmarkiertes SEPT7), verschmelzen die SEPT7- und SEPT6-Banden aufgrund ihres vergleichbaren Molekulargewichts manchmal. Der nächste Schritt besteht darin, die Fraktionen zu bündeln und sie gegen den Septinpuffer mit DTT zu dialysieren. Wenn nach der Dialyse die Konzentration zu niedrig ist (<2 μM) oder eine höhere Konzentration für die Experimente benötigt wird, kann ein Konzentrationsschritt einbezogen werden, wie im Protokoll beschrieben. Konzentrationen unter 1 μM deuten in der Regel auf eine schlechte funktionelle Qualität der Septine hin. Eine endgültige Septinkomplexkonzentration zwischen 3,5 μM und 7 μM eignet sich gut für die meisten In-vitro-Assays . Diese Konzentrationen werden normalerweise erreicht, wenn das Volumen nach der Konzentration 0,5-1 ml erreicht. Abbildung 2: Beispielchromatogramme entsprechend der Reinigung von dunklem menschlichem Septin octamers_9i1 . (A) HisTrap-Säulenchromatogramm. Nach dem Septin-Elutionspeak geht die Absorption nicht auf Null zurück, wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von Imidazol im Puffer. Die gepoolte Fraktion ging vom Beginn des Elutionspeaks bis zur Stabilisierung der Absorption bei etwa 250 ml. (B) StrepTrap-Säulenchromatogramm. Die gepoolte Fraktion ging vom Beginn des Elutionspeaks an, bis die Absorption bei 50 ml wieder auf etwa 0 zurückging. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Um mit der Qualitätskontrolle fortzufahren, wurde eine native Elektrophorese durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben (Abbildung 3B). In den Gelen kann eine Hauptbande beobachtet werden, die den intakten Hetero-Oligomeren entspricht, und üblicherweise eine kleine Bande, die den Dimeren entspricht. Menschliche Hexamer befinden sich etwas oberhalb des 242-kDa-Markerbandes, während Oktamere oberhalb des 480-kDa-Bandes oberhalb ihrer berechneten Molekülmasse gefunden werden. Die Lage dieser Banden wurde durch Western-Blot-Analyse von eukaryotischen Zellextraktenüberprüft 32. Das Tagging mit msfGFP koppelt jeden SEPT2 mit einem msfGFP-Protein. Dies führt zu einer Erhöhung des Molekulargewichts von Septinkomplexen um 53,4 kDa (26,7 kDa/msGFP-Molekül). Dennoch ist auf dem nativen Elektrophoresegel das scheinbare Molekulargewicht der msfGFP-markierten Komplexe nicht von dem der nicht markierten Komplexe zu unterscheiden. Eine ergänzende Technik, um zu testen, ob die Septinkomplexe intakt sind, ist die Massenphotometrie mittels iSCAT-Mikroskopie. iSCAT überwacht die Lichtstreuung von Molekülen, die auf einem Objektträger landen, verstärkt durch Interferenz mit Referenzlicht, typischerweise die Reflexion des Lasers auf dem Boden des Objektträgers. Dann wird ein Hintergrundsubtraktionsansatz verwendet, um den Partikeln einen Kontrast zu geben. Aufgrund dieser Korrektur zeigt das Signal positive und negative Werte an, je nachdem, ob die Partikel auf dem Glas landen oder sich von ihm entfernen49. Das detektierte Signal ist direkt proportional zum Molekulargewicht der Proteine50. Daher kann eine Signal-zu-Masse-Kalibrierung mit einem Massenstandard die Masse der Probenproteine bestimmen. Abbildung 3C zeigt ein Beispiel für menschliche Septin-Oktamere, die SEPT9_i1 enthalten. Die meisten der detektierten Einzelpartikel (~50%) haben ein Molekulargewicht, das für vollständige Oktamere mit SEPT9_i1 (423 kDa) erwartet wird (Abbildung 3C). Es gibt auch Partikel mit Massen zwischen 150-300 kDa, aber es wird kein klarer Peak beobachtet, was auf das mögliche Vorhandensein anderer Septinspezies in geringer Häufigkeit hinweist. Ebenso haben die meisten der detektierten Einzelpartikel für mEGFP-markierte Drosophila-Hexamer ein Molekulargewicht, das für intakte Hexamer erwartet wird (361 kDa) (Abbildung 3D). Ein zusätzlicher klarer Peak bei 241 kDa zeigt das Vorhandensein stabiler Tetramere an, die zwei Erdnussproteine enthalten, ein DSep1 und ein mEGFP-DSep2. Schließlich zeigen sowohl der menschliche als auch der Fliegenseptinkomplex einen Peak um 80 kDa, der eine Mischung aus Monomeren und Dimeren sein könnte, möglicherweise verstärkt durch eine Spur von DTT oder einem anderen kleinen Molekül, das aggregiert, was einen Peak in der positiven Seite des Diagramms45 zeigt. Abbildung 3: Beispiele für Ergebnisse der Oligomer-Qualitätskontrolle . (A) Beispiel für ein Denaturierungsgel, das verschiedene Anteile des Elutionspeaks aus der Reinigung von dunklem menschlichem Septin octamers_9i1. (B) Beispiel für eine native Elektrophorese verschiedener Septinkomplexe. (C,D) Verschiedene Beispiele für Histogrammergebnisse der Massenphotometrie bei 12,5 nM Septinkomplexen: (C) dunkles humanes Septin octamers_9i1 und (D) DSep1-msfGFP Drosophila septin hexamers. Linien sind Gaußsche Anfälle. (E) TEM-Bild von 25 nM dunklem menschlichem Septin octamers_9i1 im Septinpuffer. Maßstabsbalken = 200 nm. (F) Klassendurchschnittsbild von SEPT2-msfGFP humanem Septin octamers_9i1. Die msfGFP-Tags sind als Fuzzy-Dichten an den beiden Enden sichtbar. Maßstabsbalken = 10 nm. Die Tafeln (E) und (F) unterliegen dem Copyright von The Company of Biologists und wurden mit Genehmigung von Iv et al.10 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Da sowohl native Gele als auch iSCAT nur ensemblegemittelte Informationen liefern, wurde die Klassenmittelung von Transmissionselektronenmikroskopiebildern einzelner Septin-Oligomere verwendet, um die Integrität und Reinheit der Komplexe durch direkte Visualisierung zu überprüfen. In TEM-Bildern von Septinkomplexen im Septinpuffer können Stäbchen von 24 nm (Hexamer) oder 32 nm (Oktamere) Länge beobachtet werden. Ein Beispiel für ein menschliches Septin-Oktamer, das SEPT9_i1 enthält, ist in Abbildung 3E zu sehen. Bei Klassenmittelung kann jede der Untereinheiten beobachtet und gezählt werden, wie für den msfGFP-markierten menschlichen Oktamer mit SEPT9_i1 in Abbildung 3F zu sehen ist. Wenn das Oligomer fluoreszierend markiert ist, können zusätzliche Dichten beobachtet werden, die dem SEPT2-msfGFP am Ende der Stäbchen entsprechen (Abbildung 3F). Die Kombination der oben genannten Techniken beweist, dass Oktamere (oder Hexamere) mit dem richtigen stöchiometrischen Verhältnis und hoher Reinheit unter Verwendung des beschriebenen Protokolls gereinigt werden können. Die letzte Qualitätskontrolle schließlich betrifft die Funktionalität der Septinkomplexe hinsichtlich ihrer Polymerisationsfähigkeit. In Gegenwart einer niedrigen Salzkonzentration (<150 mM KCl mit dem beschriebenen Puffer 9) lagern sich Septine, wenn sie nicht in Gegenwart anderer Proteine oder negativ geladener Lipidmembranen vorliegen, zu Bündeln9 zusammen. Septine werden an der Polymerisation gehindert, indem sie im Speicherpuffer gehalten werden, der eine hohe (300 mM) KCl-Konzentration aufweist. Die Septin-Hetero-Oligomere werden dann in einem Puffer der gleichen Zusammensetzung, jedoch ohne KCl, mit einem Volumenverhältnis von 1:6 verdünnt, um eine endgültige KCl-Konzentration von 50 mM zu erreichen. Für die Fluoreszenzbildgebung wird dieser Puffer durch ein Sauerstofffängersystem zum Schutz vor Photobleiche und durch einen blinkenden Suppressor ergänzt. In der TIRF-Mikroskopie können kleine Cluster von Proteinen innerhalb des flachen TIRF-Feldes (~100 nm; Abbildung 4A,B). Auf einem konfokalen Mikroskop sind große Cluster filamentöser Strukturen zu sehen, die weiter oben in Lösung schweben (Abbildung 4C). Schließlich können mit TEM kleine Bündel von Septin (Abbildung 4D), die den von TIRF beobachteten Clustern entsprechen, und große Bündel (Abbildung 4E), die den durch konfokale Mikroskopie beobachteten Strukturen entsprechen, beobachtet werden. Die Einschübe in Abbildung 4D,E zeigen, dass beide Arten von Strukturen aus langen, dünnen Filamenten bestehen, die parallel verlaufen und Bündel mit konischen Enden bilden. Zusammen beweisen die Fluoreszenz- und TEM-Bilder, dass die gereinigten Septinkomplexe zu Filamenten polymerisieren können, die sich wiederum selbst zu Bündeln zusammensetzen. Abbildung 4: Beispiele für Ergebnisse der Qualitätskontrolle der Polymerisationsfähigkeit. (A) TIRF-Bild von 300 nM humanen Septin-Hexamern (10% msfGFP-markierte Hexamere) in fluoSPB. (B) TIRF-Bild von 300 nM humanen Septin-Oktameren mit SEPT9_i1 (10% msfGFP-markierte octamers9_i1) in fluoSPB. (C) Konfokale Projektionen mit maximaler Intensität von Z-Stacks über ~30 μm mit 0,5 μm Abstand von 300 nM menschlichem Septin octamers_9i3 in fluoSPB. (A-C) Maßstabsbalken = 10 μm und invertierte Graustufen. (D,E) Beispiele für TEM-Bilder von (D) kleinen und (E) großen Bündeln von menschlichem Septin, die in darkSPB octamers_9i1. Einschübe zeigen Regionen, in denen klare Filamente beobachtet werden können, die innerhalb des Bündels parallel verlaufen. Maßstabsbalken = 500 nm. Panels (C-E) unterliegen dem Copyright von The Company of Biologists und wurden von Iv et al.10 mit Genehmigung angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Tabelle 1: Liste der Plasmide. Plasmide zur Reinigung von Septin-Oligomeren nach diesem Protokoll. Alle Plasmide wurden in Addgene deponiert (erste Spalte). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Tabelle 2: Liste der Puffer. Pufferzusammensetzungen zur Reinigung und Qualitätskontrolle von Septin-Oligomeren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Tabelle 3: Molekulargewichte und Extinktionskoeffizienten. Liste der Molekulargewichte (MW) und optischen Extinktionskoeffizienten (ε) bei einer Wellenlänge von 280 nm, berechnet mit ProtParam basierend auf den Sequenzen des Komplexes, unter der Annahme einer linearen Fusion der Septin-Untereinheiten, der verschiedenen Septin-Komplexe und der eindeutigen Septin-Untereinheiten (nur MW), die mit den in Tabelle 1 aufgeführten Plasmiden gereinigt werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die robuste Reinigung und Qualitätskontrolle von vorgeformten Septin-Hetero-Oligomeren. Einige der wichtigsten Aspekte, die für die korrekte Anwendung der Methode zu berücksichtigen sind, sind wie folgt. Während der Elutionsschritte in den chromatographischen Trennungen ist es wichtig, die empfohlene (oder niedrigere) Durchflussrate zu verwenden, um die Verdünnung der Septinkomplexe zu minimieren. Um die Rückgewinnung des Proteins während des letzten Konzentrationsschritts zu maximieren, ist die Konzentratorsäule so ausgerichtet, dass die Lösung nicht gegen den Filter gedrückt wird (wenn sich nur ein Filter auf einer Seite befindet). Wenn die Lösung direkt in den Filter gelangt, haftet das Protein viel mehr daran, was die Endausbeute erheblich verringert. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass der Konzentrationsschritt nicht immer notwendig ist. Das Picken von Fraktionen nur aus einem engen Bereich um den Peak im Chromatogramm ergibt normalerweise eine ausreichend hohe Stammkonzentration (>3.000 nM) für viele Rekonstitutionsanwendungen (die normalerweise zwischen 10-300 nM arbeiten). Schließlich ist es für die Qualitätskontrolle der Funktionalität der Septinkomplexe durch Fluoreszenzmikroskopie wichtig, die Oberfläche der Mikroskopie-Objektträger korrekt zu passivieren, da Septinkomplexe eifrig an Glas haften. Die Passivierung der Glasobjektträger kann entweder durch PLL-PEG-Funktionalisierung oder durch die Bildung neutraler (100% DOPC) unterstützter Lipiddoppelschichten^11,32 erfolgen.

Im Vergleich zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll, das erstmals in Iv et ^al.10 beschrieben wurde, gibt es eine Änderung in den Pufferzusammensetzungen (Tabelle 2). Die Konzentration von MgCl 2 wurde von 5 mM auf₂ mM reduziert, und die Konzentration und der pH-Wert von Tris-HCl wurden von 50 mM auf 20 mM bzw. von 8,0 auf 7,4 reduziert. Diese Änderungen wurden vorgenommen, um die Pufferbedingungen mit Studien über die Wechselwirkungen menschlicher Septine mit Lipiddoppelschichten, Aktinfilamenten und Mikrotubuli kompatibel zu machen^10,11,32. Dies liegt daran, dass die Autoren im F-Puffer unterstützte Lipiddoppelschichten und polymerisiertes Aktin gebildet haben, dessen Zusammensetzung mit der von darkSPB identisch ist, abgesehen von der Anwesenheit von ATP im F-Puffer. Der Pufferwechsel führte zu keinen Änderungen in der Qualität oder Lebensdauer der gereinigten Septine im Vergleich zu den ursprünglichen Puffern.

Diese Reinigungsmethode hat noch einige Einschränkungen. Erstens können verschiedene Reinigungsversuche in der Ausbeute (0,5-1 ml 2-5 μM Septinkomplexe) und der funktionellen Qualität variieren, was durch die Bündelbildungsfähigkeit der gereinigten Septinkomplexe überprüft wird. Deshalb ist es sehr wichtig, die in diesem Beitrag beschriebenen Qualitätskontrollen konsequent durchzuführen. Eine sehr gute Kontrolle der Expressionszeiten und der optischen Dichte der Bakterienkultur kann dazu beitragen, den Ertragsunterschied zu mildern. Zweitens kann diese Reinigungspipeline nicht zwischen Trimeren und Hexameren oder zwischen Tetrameren und Oktameren unterscheiden (Abbildung 1B). Die Qualitätskontrollexperimente können jedoch verwendet werden, um nachzuweisen, dass die Mehrheit der Septinkomplexe in ihrer langen Oligomerform vorliegt. Falls eine noch engere Oligomergrößenverteilung erforderlich ist, kann die Größenausschlusschromatographie zwischen Schritt 1.6 eingefügt werden. und Schritt 1.7. des Reinigungsprotokolls. Dieser optionale Schritt verringert jedoch den Ertrag drastisch und wird nicht empfohlen, es sei denn, er ist unbedingt erforderlich. Eine letzte, grundlegendere Einschränkung ergibt sich aus der Verwendung von E. coli als Expressionssystem für rekombinante Septinkomplexe. Natürlich erlaubt dieses System keine posttranslationalen Modifikationen (PTMs), wie sie in tierischen Zellen berichtet wurden, wie Phosphorylierung, Acetylierung und Sumoylierung 6,51,52,53. Diese posttranslationalen Modifikationen könnten durch die Implementierung einer ähnlichen Reinigungsstrategie in Insekten- oder menschlichen Zellen hinzugefügt werden. Darüber hinaus hat diese Arbeit nur die Rekonstitution von Septinen selbst diskutiert, aber Studien an Zellen deuten darauf hin, dass regulatorische Proteine wie Proteine aus der Borg-Familie 54,55 und Anillin ^24,25,56 substanzielle, aber wenig verstandene Auswirkungen auf die Assemblierung und Funktion von Septinen haben können und daher wichtig sind, um sie schließlich in vitro zu integrieren. Studium. Protokolle für die Reinigung von Borg-Proteinen und Anillin wurden berichtet^54,57.

Das hier beschriebene Septin-Reinigungsprotokoll bietet eine standardisierte Möglichkeit, Septine in ihrer Oligomerform mit der korrekten Untereinheitsstöchiometrie zu reinigen, was einen wichtigen Fortschritt gegenüber vielen früheren In-vitro-Studien darstellt, die auf einzelnen Septin-Untereinheiten basieren. Obwohl einige Septine in bestimmten Kontexten als einzelne Untereinheit² fungieren können, deutet die aktuelle Literatur stark darauf hin, dass Septine in tierischen Zellen hauptsächlich in Komplexen ^9,58 funktionieren. Daher ist die Verwendung von vorgeformten Hetero-Oligomeren, wie sie in diesem Artikel und anderen 10,11,18,32,35,36,37 beschrieben sind, von großer Bedeutung^, um die strukturellen und biophysikalischen Eigenschaften von Septinen in vitro zu untersuchen. Rekonstitution, um ihre Funktionen in der Zelle zu sezieren. Darüber hinaus sind Septine selbstorganisierende Proteine mit vielen Interaktionspartnern, einschließlich der Membran und des Zytoskeletts, was sie für die Bottom-up-synthetische Biologie 59,60,61 und Studien über proteininduzierte Veränderungen der biophysikalischen Eigenschaften der Membran wie Krümmung^42,62,63 von großem Interesse macht.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay und Katharina Häußermann für ihre Unterstützung bei Massenphotometrie-Experimenten (iSCAT); Arjen Jakobi und Wiel Evers für ihre Hilfe bei TEM; Lucia Baldauf für ihre Unterstützung bei TIRF; Pascal Verdier-Pinard für seinen Rat zur nativen Elektrophorese; Agata Szuba und Marjolein Vinkenoog für ihre Hilfe beim Aufbau der Drosophila-Septin-Reinigung und der Zell- und Gewebebildgebung (PICT-IBiSA), Institut Curie, Mitglied der französischen nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). Diese Forschung wurde von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/OCW) durch das Gravitationsstipendium “BaSyC-Building a Synthetic Cell” (024.003.019) und durch die Agence Nationale pour la Recherche (ANR-Zuschüsse ANR-17-CE13-0014: “SEPTIMORF”; ANR-13-JSV8-0002-01: “SEPTIME”; und ANR-20-CE11-0014-01: “SEPTSCORT”).

Materials

488nm laser combiner iLAS2	Gataca		TIRF microscope
488nm Sapphire laser lines	Coherent		Confocal microscope
4k X 4k F416 CMOS camera	TVIPS		For JEM-1400plus
4x sample buffer nativePAGE	Thermo Fisher scientific	BN2003
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813	To prevent blinking
AKTA pure 25 M1	GE healthcare	1680311
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518-25G
Carbon Type-B, 300 mesh EM grid	Ted pella	01813-F
Carbon Type-B, 300 mesh EM grid	Electron micoscopy sciences	CF300-Cu
Cover glass #1.5H	Thorslabs	CG15KH
CSU-X1-M1 confocal unit	Yokogawa		Confocal microscope
Desthiobiotin	Sigma-Aldrich	D1411-1G
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779
DNAse	Sigma-Aldrich	10104159001
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
Eclipse Ti2-E	Nikon instruments		Confocal microscope
EDTA-free protease inhibtor cocktail	Roche	481761
HisTrap HP, 5 mL	GE healthcare	29-0588-3
iLAS2 azimuthal TIRF illumination system	Gataca		TIRF microscope
Imidazole	Sigma-Aldrich	1202-1KG
InstantBlue Protein Gel Stain	Westburg Life Sciences	EP ab119211
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher scientific	10849040
iXon Ultra 888 EMCCD camera	Andor		Confocal microscope
iXon Ultra 897 EM-CCD	Andor		TIRF microscope
JEM-1400plus	JOEL		TEM microscope TUDelft
kappa-cassein	Sigma-Aldrich	C0406
LB broth	Sigma-Aldrich	L3022-6X1KG
Lyzozyme	Sigma-Aldrich	62971-10G-F
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	746452-1KG
Methylecllulose	Sigma-Aldrich	8074844
MilliQ system (Integral 10)	Merck-Millipore		I-water dispenser
Mini protean TGX gels	BIORAD	4561086
NativeMark unstained protein standard	Invitrogen	LC0725	For iSCAT and Native gels
NativePAGE 4-16% GELS	Thermo Fisher scientific	BN1002BOX
NativePAGE Running Buffer kit	Thermo Fisher scientific	BN2007
Nikon Ti2-E	Nikon instruments		TIRF microscope
Nr. 1 Menzel coverslips	Thermo Fisher scientific	11961988
parafilm	Sigma-Aldrich	P7668
Plan Apo ×100/1.45 NA oil immersion objective	Nikon instruments		Confocal microscope
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)	SuSoS	CHF560.00
Poly-L-lysine solution 0.01%	Sigma-Aldrich	P4832	For iSCAT glass slides
Pottassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
Power supply for native gels	CONSORT	S/N 71638
POWERPAC UNIVERSAL	BIORAD	042BR31206
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oxygen scavenger – enzyme
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	03930590-50MG	oxygen scavenger – reagent
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110
Quemesa camera	Olympus		For Tecnai Spirit
Refeyn OneMP	Refeyn
Sample buffer, laemmli 2x concentrate	Sigma-Aldrich	S3401-10vl
Silicon gaskets	Sigma-Aldrich	GBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL	Thermo Fisher scientific	66381
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	PHR1441-1G
StrepTrap HP, 1 mL	GE healthcare	28-9075-46
Tecnai Spirit microscope	Thermo Scientific, FEI		TEM microscope Institute Curie
Terrific broth	Sigma-Aldrich	T0918-1KG
Tris/Glyine/SDS buffer	BIORAD	1610772
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941-1KG
Ultrasonic cleaner	Branson	CPX2800H-E
Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES	Sartorius	VS0622

Referencias

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Castro-Linares, G., den Haan, J., Iv, F., Silva Martins, C., Bertin, A., Mavrakis, M., Koenderink, G. H. Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution. J. Vis. Exp. (184), e63871, doi:10.3791/63871 (2022).