使用代谢标记和质谱法测量衰老和非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

1.制备静止细胞和暴露于电离辐射（IR）而变衰老的细胞 注意：可以使用多种方法诱导细胞衰老和静止，如其他地方33，34，35中详细描述的那样。用于诱导衰老和静止的刺激可能取决于感兴趣的细胞类型和所研究的生物学问题。本研究中使用的细胞是市售的。 从冷冻管中解冻人二倍体IMR-90成纤维细胞（〜1 x 106 细胞），并将其接种在150mm板上的20mL DMEM中，并补充有10%胎牛血清（FBS）（表1）。 在生理氧气条件下（3%O2， 5%CO2， 37°C）生长细胞，并在10%含FBS的培养基中扩增培养物，直到建立足够的淬灭和衰老细胞重复（建议每种情况至少3-5次重复）。注意：在生理（3%）氧气下培养细胞是原代人成纤维细胞的理想选择，但其他细胞类型的合适培养条件可能会有所不同，应根据具体情况确定。 通过将增殖细胞暴露于15灰色（Gy）的电离辐射（IR）来产生衰老细胞。注意：辐射暴露的强度可能因细胞类型而异。虽然这里使用15 Gy，但10 Gy也是成纤维细胞常用的辐射剂量;其他细胞，如单核细胞，可能需要低至5 Gy的剂量。剂量通常通过权衡抗衰老诱导的可行性来经验确定。 将细胞在含有10S的培养基中以40%-60%汇合处暴露于IR中。 红外曝光后，换成含有10S的新鲜培养基。 每 2 天更换一次培养基（20 mL，含 10% FBS），持续 8 天。注意：细胞以较低的汇合度暴露于IR，因为IR处理的细胞在停止生长之前会在培养物中扩增。在这个实验中，细胞在衰老的建立过程中没有分裂细胞，虽然它们变得更加融合，但它们在收获时仍然显示出衰老细胞标志物。在成纤维细胞中，衰老表型在7-10天内发展。 通过将接种增殖细胞上的培养基更换为含有0.2S（血清饥饿）的培养基来产生静止的对照细胞（表1）。 继续生长将用于含有10S的培养基中的静止控制的细胞，直到衰老细胞暴露于IR后的第4天，必要时分裂。 在IR后的第4天，将静止细胞的培养基更换为含有0.2S的20mL培养基（表1），并继续生长6天，每2天更换一次培养基。注意：即使在含有0.2S的培养基中，成纤维细胞也会继续生长，并且在收获结束时可能会出现汇合。根据经验，当静止细胞达到类似于衰老细胞培养物的汇合度时，旨在收集它们。 2. 脉冲 SILAC 细胞标记和裂解物收获 将衰老和静止细胞（12块板）上的培养基更换为SILAC Light（表1）并生长2天。注意：这种标记有助于减少背景噪声，因为 13C和 15N的自然丰度较低。在试剂限制条件下可以跳过此步骤，但会导致对新蛋白质合成的轻微高估。 用 SILAC DMEM（表 1）替换培养基以进行代谢标记。注意：SILAC DMEM培养基经过专门配制，含有精氨酸和赖氨酸的纯轻或重同位素，用于代谢标记。不得用子步骤2.2.1或2.2.2中的标准DMEM配方代替它们。 对于三个衰老板和三个静态板，用30 mL SILAC Light替换培养基（表 1），并在不更换培养基的情况下生长3天。 对于至少三个衰老板和三个静态板，用 30 mL SILAC 重质试剂（表 1）替换培养基，并在不更换培养基的情况下生长 3 天。注意：此时可以选择立即收获光标记的细胞，而不是将它们再标记3天。对于单个时间点，最好在与该协议中相同的时间段内标记重和轻标记的细胞，以最小化批次效应。 通过将5mL预热胰蛋白酶试剂添加到每个培养皿中并在37°C下孵育5分钟，将细胞从培养板中分离出来。 将分离的细胞重悬于5mL用于培养的相同培养基（SILAC轻质或SILAC重质）中，总体积为10mL。 收获细胞以提取裂解物和验证衰老标志物。 对于每个悬浮液，将0.6×106 个细胞等分试样到2mL含有0.2S的培养基中，在6孔培养皿（两个培养皿，一个用于SILAC轻培养细胞和一个用于SILAC重培养细胞）中，并置于37°C下孵育过夜。注意：这些板（子步骤2.5.1）将用于检测衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-βGal）活性（步骤3.1）。 对于每个悬浮液，将1×106 的细胞等分试样放入微量离心管中，并在台式离心机中全速旋转1分钟。除去上清液并将沉淀重悬于1mL苯酚中;在此步骤中，RNA可以完全纯化，如苯酚供应商手册中所述，或在-80°C下长期储存。注意：苯酚具有腐蚀性，应仅在戴手套和实验室外套的兜帽中处理。注意：提取的RNA将用于检测编码SASP因子的mRNA，使用逆转录（RT），然后进行实时定量（q）PCR（RT-qPCR）分析（步骤3.2）。衰老诱导的另一个可靠测定是5-乙炔基二羟基尿苷（EdU）掺入的试验，这表明存在增殖细胞。没有增殖可用于确认静止和衰老。 将剩余的细胞转移到冰上，并在300× g 和4°C下旋转。 除去上清液，在1 mL冷PBS中洗涤细胞两次，以从培养基中除去胎牛血清中的培养基/胰蛋白酶和外源性蛋白质污染。 再次旋转细胞，除去上清液，然后继续裂解。 将细胞沉淀重悬于150μL新鲜制备的8M尿素50mM碳酸氢铵裂解缓冲液中（表1），并通过上下移液混合。 将裂解物在水超声仪中超声处理2.5分钟，在4°C下以中等功率开/关30秒。 将裂解物转移到预热的95°C热块中并使其变性4分钟。 旋转裂解物;裂解物现在可以储存在-80°C或立即用于定量。 在裂解缓冲液中为每个裂解液制作30μL1：10稀释液。 使用BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度，使用在ddH2O稀释的1/10x裂解缓冲液中制备的标准曲线，裂解物现在可以无限期地储存在-80°C。 3. 通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-βGal）活性和衰老相关mRNA的RT-qPCR分析来验证衰老 注意：这些步骤的起始材料是在步骤 2.5 中收集的 从在亚步骤2.5.1中设置的6孔板开始，按照制造商的方案使用衰老β半乳糖苷酶染色试剂盒分析细胞的SA-βGal活性。在启用颜色的情况下在明场下可视化染色，如前所述36。注意：SA-βGal通过比较衰老与静止对照条件下阳性细胞（可见蓝色）的百分比来量化。至少70%的细胞应为SA-βGal阳性，以成功确认衰老。静态对照细胞的 SA-βGal 阳性率应小于 10%。 从苯酚悬浮液中提取RNA（亚步长2.5.2），并使用RT-qPCR分析编码SASAP因子（IL6，CXCL8，IL1B），细胞周期标志物（CDKN2A / p16，CDKN1A / p21）和其他衰老指标（LMNB1和PCNA丢失）水平升高。注意：RNA是不稳定的，因此应使用无RNase的设备，新鲜手套和冰处理，除非方案中另有说明。 从苯酚悬浮液开始，每1mL苯酚加入200μL氯仿，并在4°C下以12，000× g 旋转15分钟。 小心地除去水相并加入1：1体积的异丙醇，15μg糖原共沉淀剂，然后在4°C下孵育10分钟以沉淀RNA。 孵育后，通过在4°C下以12，000× g 离心20分钟沉淀RNA，然后在75%EtOH中洗涤等于1体积的苯酚。将RNA重悬于50μL无核酸酶蒸馏水中;RNA可以无限期地储存在-80°C。 在RNA样品中，加入38μL无核酸酶蒸馏水，10μL10x DNAse反应缓冲液和2μLDNase I，然后混合。注意：生成子步骤 3.2.3 中所有试剂的通用混合物乘以用于处理的样品数量，以便与样品均匀分布是最佳做法。 将DNANase I处理的RNA样品在37°C下孵育30分钟。 使用1体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混合物从样品中除去DNA酶，方法是在台式离心机中以最大速度涡旋和旋转5分钟;RNA将包含在水相中。 重复亚步骤3.2.2和3.2.3以沉淀RNA。重悬于20μL无核酸酶蒸馏水中;RNA可以无限期地储存在-80°C。 通过将0.5-1.0μg纯化的RNA与200 U逆转录酶，100 pMol随机引物和10mM dNTP混合物在1x反应缓冲液中与逆转录酶一起孵育，从纯化的RNA中产生cDNA;在25°C下孵育10分钟，然后在50°C下孵育30分钟，最后在85°C下灭活5分钟。 使用实时定量（q）PCR分析，从静态对照和衰老细胞的RT步骤（亚步3.2.3）分析cDNA，以评估已知增加的mRNA标记物的水平（CDKN2A / p16， CDKN1A / p21， IL1B， IL6和 CXCL8 mRNA）或降低（LMNB1 和 PCNA mRNA）随着衰老而降低，如其他地方所述。 ACTB mRNA编码管家蛋白β-肌动蛋白，通常是一种很好的mRNA，可以归一化输入材料中的差异。使用的引物见 表2。注意：相对RT-qPCR分析取决于靶引物对和参考引物对之间具有相等结合效率的假设。这些假设应该针对新的引物集进行测试，详见其他37。此外，所比较的细胞类型之间的参考标记物应该是恒定的，并且先前已经确定了衰老细胞的几个附加选择38。 4. 溶液内胰蛋白酶消化 注意：从现在开始，使用质谱级缓冲液，溶剂和化学品以防止质谱分析过程中杂质的干扰至关重要。所有缓冲液应由适合液相色谱串联质谱分析的成分组成，包括水和乙腈。有关合适的化学品和溶剂的列表，请参阅 材料表 。 将每个蛋白质样品的50μg等分到新管中，并与裂解缓冲液等体积。 向每个样品中，将DTT加入到最终浓度为20 mM以减少二硫键。 将样品在37°C下振荡孵育30分钟，然后让样品在室温（RT，〜10分钟）下冷却。 将碘乙酰胺加入到40mM的终浓度中，以不可逆地烷基化在上一步中还原的巯基。将样品在室温下在黑暗中孵育30分钟。 用由50mM碳酸氢铵组成的缓冲液将每个样品稀释至1M以下尿素。通过在pH条上移液少量样品来检查pH值是否约为8。 向每个样品中加入1μg胰蛋白酶，以获得50μg起始蛋白，或者如果消化不同的蛋白质量，则按质量按质量以1：50的胰蛋白酶：蛋白质比。例如，将加入3μg胰蛋白酶以消化150μg蛋白质。 将样品在37°C下振荡孵育过夜，以将蛋白质消化成肽。 将甲酸加入每个样品的1%，按体积计，以淬灭蛋白质消化。注意：实验可以在此处暂停。将样品在-80°C下冷冻，如有必要，稍后继续下一步。 5. 固相萃取 （SPE） 样品净化 注：此固相萃取方案需要固相萃取盒和真空歧管设置。在质谱分析之前，研究人员可以自行决定进行其他等效固相萃取（SPE）方案。 通过将固相萃取滤芯放在真空歧管上，对每个样品使用一个萃取滤芯，为SPE做准备。注：请参阅制造商的指南，了解 SPE 协议中使用的吸附剂量。对于50μg肽样品，建议使用10mg吸附剂柱。 通过加入800μLSPE洗脱缓冲液（表1）来调节每个SPE滤芯，并使用真空抽吸将溶剂吸入滤芯。 重复步骤 5.2。 通过加入800μLSPE洗涤缓冲液（表1）平衡每个滤芯，并使用真空抽吸将缓冲液吸入滤芯。 再重复步骤 5.4 两次，共重复三次。 将肽样品装入SPE滤芯，并使用真空抽吸将样品通过试样。注意：此时，肽与滤芯内的吸附剂结合。 用 SPE 洗涤缓冲液清洗每个滤芯，然后使用真空抽吸将缓冲液吸入滤芯。 再重复步骤5.7两次，共洗涤三次。 在洗脱步骤之前，将收集管布置在每个滤芯下方的真空歧管内，小心地确保收集管和滤芯之间的对准。 要洗脱肽，向每个滤芯中加入800μLSPE洗脱缓冲液，并将肽洗脱到真空抽吸的收集管中。 用400μLSPE洗脱缓冲液重复步骤5.10。 从真空歧管中取出肽样品，并在真空浓缩器中完全干燥（干燥大约需要3小时）。注意：实验可以在此处暂停。在-80°C下冷冻样品，如有必要，可在以后继续。 6. 数据依赖性采集（DDA）质谱分析 将肽样品以400ng / μL的浓度重悬于由水中0.2%甲酸组成的缓冲液中。 为了帮助肽的再溶解，涡旋样品5分钟。然后，在水浴超声仪中超声处理样品5分钟。 通过在4°C下以15，000× g 离心样品15分钟来沉淀任何不溶性材料。 将肽上清液转移到MS小瓶中。 按体积将所选的索引保留时间（iRT）肽标准品以1：30 iRT：样品的浓度添加到每个样品中。 使用液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析提交样品进行蛋白质组学分析。 使用质谱机构推荐用于非靶向分析的LC-MS / MS设置。分析的示例设置如图 3所示，配置为在Orbitrap质谱仪上进行分析，该质谱仪以纳米流动模式耦合到纳米液相色谱系统。下面是一个示例协议。 将每个样品的1μg（5μL）上加载到捕集柱（1cm长x 100μm直径）上，并以10μL / min的流速用上样溶剂（表1）洗涤5分钟。 将样品加载到分析柱（50 cm 长 x 100 μm 直径）上，流速为 400 nL/min。 用有机溶剂（0.2%甲酸和99.8%乙腈）和无机溶剂（0.2%甲酸在99.8%水中）在90分钟的线性梯度上洗脱肽，范围为5%至35%有机溶剂。 在数据依赖模式下获取质谱数据，连续循环MS1调查扫描（60，000分辨率，3e6 AGC靶标，100 ms最大累积时间和400-1，600 m / z质量范围），然后进行20次数据依赖性MS2扫描（15，000分辨率，1e5 AGC靶标，25 ms最大注射时间和1.6 m / z宽度隔离窗口），并进行HCD碎片（归一化碰撞能量为27%）。 在MS采集所有样品后，将原始质谱文件导入质谱蛋白质组学分析软件工具，用于鉴定和定量肽峰区域。注意：为了鉴定本实验中的肽和蛋白质，Mascot数据库搜索工具与审查的UniProt人蛋白质组序列数据库（蛋白质组ID：UP000005640）一起使用。在Mascot中指定了以下搜索参数： 定量：SILAC K+8 R+10 [MD] 酶：胰蛋白酶/p 固定修饰：氨基甲酸甲酯（C） 可变修饰： 乙酰（蛋白质 N 项）， Gln->热糖胶 （N 项 Q）， 氧化 （M）， 标签：13C（6）15N（2） （K）， 标签：13C（6）15N（4） （R） 肽质量耐受性： 10 ppm 碎片质量公差：0.08 Da 最大漏数： 2 所有未指定的参数均为默认值 在蛋白质组定量软件工具中定量重肽和轻肽的肽峰区域。为了量化本实验中的峰面积，使用了免费开源的Skyline软件平台39，40。导出重肽和轻肽峰区，用于估计蛋白质半衰期。 7. 蛋白质半衰期的计算 打开 SILAC 分析工作手册（表 3）到第一个名为 1） 原始数据 ，并将 UniProt ID、基因名称、重峰区域和轻峰区域粘贴到指示的列中（SH = 衰老-重，SL = 衰老-轻，CH = 对照（静止）-重，CL = 控制（静止）-轻）。 打开2-4张，确保UniProt ID和Gene柱与分析中鉴定的蛋白质数量相匹配（这些实验鉴定了841种蛋白质）。其余列在被拖动以覆盖已识别的蛋白质后将自动填充数据。 打开名为 4）分析 的第四个工作表，并删除列G和H指示样本超出范围的行;将读取的行保持在范围内。第五张工作表中的火山图将自动填充。