Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Bij de muis begint dit proces op embryonale dag (E) 9,5 met de vorming van de frontonasale prominentie en paren van maxillaire en mandibulaire processen, die elk post-migrerende craniale neurale crestcellen bevatten. De laterale en mediale nasale processen ontstaan uit de frontonasale prominentie met het verschijnen van de neusputten en smelten uiteindelijk samen tot de neusgaten. Verder smelten de mediale neusprocessen en maxillaire processen samen om de bovenlip te genereren. Tegelijkertijd wordt palatogenese geïnitieerd met de vorming van verschillende uitwassen – de secundaire palatale planken – van de orale kant van de maxillaire processen bij E11.5. Na verloop van tijd groeien de palatale planken aan weerszijden van de tong naar beneden, verheffen zich tot een tegengestelde positie boven de tong en smelten uiteindelijk samen aan de middellijn om een continu gehemelte te vormen dat de neus- en mondholten scheidt door E16.5¹.

Deze morfologische veranderingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling worden geïnitieerd en ondersteund door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylatie door kinasen. Celmembraanreceptoren, zoals subfamilies van transformerende groeifactor (TGF)-β receptoren, waaronder botmorfogenetische eiwitreceptoren (BMPRs) en verschillende receptor tyrosinekinase (RTK) families, worden bijvoorbeeld autofosforyleerd op ligandbinding en activering in craniale neurale crestcellen ^2,3,4 . Bovendien wordt de G-eiwit-gekoppelde transmembraanreceptor Smoothened gefosforyleerd in craniale neurale crestcellen en craniofacial ectoderm stroomafwaarts van Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding aan de Patched1-receptor, wat resulteert in gladgestreken accumulatie op het ciliaire membraan en SHH-routeactivering⁵. Dergelijke ligand-receptor interacties kunnen optreden via autocriene, paracriene en / of juxtacrine signalering in craniofaciale contexten. Van BMP6 is bijvoorbeeld bekend dat het op een autocriene manier signaleert tijdens chondrocytendifferentiatie⁶, terwijl fibroblastgroeifactor (FGF) 8 wordt uitgedrukt in het faryngeale boogectoderm en bindt aan leden van de FGF-familie van RTK’s uitgedrukt in het faryngeale boogmes mesenchym op een paracriene manier om patroonvorming en uitgroei van de faryngeale bogen te initiëren^{7, 8,9,10}. Bovendien wordt Notch-signalering geactiveerd in zowel chondrocyten als osteoblasten tijdens craniofaciale skeletontwikkeling door juxtacrine-signalering wanneer transmembraandelta en / of gekartelde liganden binden aan transmembraan Notch-receptoren op naburige cellen, die vervolgens worden gesplitst en gefosforyleerd¹¹. Er zijn echter andere ligand- en receptorparen die belangrijk zijn voor craniofaciale ontwikkeling die de flexibiliteit hebben om te functioneren in zowel autocriene als paracriene signalering. Tijdens morfogenese van muizentanden is bijvoorbeeld aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF)-AA-ligand op een autocriene manier signaleert om de RTK PDGFRα in het glazuurorgaanepitheel^{te activeren 12}. Daarentegen worden bij muriene gezichtsprocessen tijdens de zwangerschap transcripten die coderen voor de liganden PDGF-AA en PDGF-CC uitgedrukt in het craniofaciale ectoderm, terwijl de PDGFRα-receptor wordt uitgedrukt in het onderliggende craniale neurale crest-afgeleide mesenchym, wat resulteert in paracriene signalering 13,14,15,16,17 . Ongeacht het signaleringsmechanisme resulteren deze receptorfosforylatiegebeurtenissen vaak in de rekrutering van adaptoreiwitten en / of signaalmoleculen, die vaak zelf gefosforyleerd worden om intracellulaire kinasecascades te initiëren, zoals de mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route^18,19.

De terminale intracellulaire effectoren van deze cascades kunnen vervolgens een reeks substraten fosforyleren, zoals transcriptiefactoren, RNA-binding, cytoskeletale en extracellulaire matrixeiwitten. Runx2²⁰, Hand1²¹, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 ²⁵ en Sox9²⁶ behoren tot de transcriptiefactoren die gefosforyleerd zijn in de context van craniofaciale ontwikkeling. Deze posttranslationele modificatie (PTM) kan direct van invloed zijn op de gevoeligheid voor alternatieve PTM’s, dimerisatie, stabiliteit, splitsing en/of DNA-bindende affiniteit, naast andere activiteiten 20,21,25,26. Bovendien wordt het RNA-bindende eiwit Srsf3 gefosforyleerd in de context van craniofaciale ontwikkeling, wat leidt tot zijn nucleaire translocatie²⁷. Over het algemeen is aangetoond dat fosforylering van RNA-bindende eiwitten hun subcellulaire lokalisatie, eiwit-eiwitinteracties, RNA-binding en / of sequentiespecificiteit^{beïnvloedt 28}. Bovendien kan fosforylering van actomyosine leiden tot cytoskeletale herschikkingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling^29,30, en fosforylering van extracellulaire matrixeiwitten, zoals kleine integrinebindende ligand N-gebonden glycoproteïnen, draagt bij aan biomineralisatie tijdens de ontwikkeling van het skelet³¹. Door het bovenstaande en tal van andere voorbeelden is het duidelijk dat er brede implicaties zijn voor eiwitfosforylering tijdens craniofaciale ontwikkeling. Door een extra niveau van regulatie toe te voegen, wordt eiwitfosforylering verder gemoduleerd door fosfatasen, die kinasen tegengaan door fosfaatgroepen te verwijderen.

Deze fosforyleringsgebeurtenissen op zowel het receptor- als effectormolecuulniveau zijn van cruciaal belang voor de voortplanting van signaalroutes en resulteren uiteindelijk in veranderingen in genexpressie in de kern, waardoor specifieke celactiviteiten worden aangedreven, zoals migratie, proliferatie, overleving en differentiatie, die resulteren in de juiste vorming van het zoogdiergezicht. Gezien de contextspecificiteit van eiwitinteracties met kinasen en fosfatasen, de resulterende veranderingen in PTM’s en hun effecten op celactiviteit, is het van cruciaal belang dat deze parameters worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving om volledig inzicht te krijgen in de bijdrage van fosforyleringsgebeurtenissen aan craniofaciale ontwikkeling. Hier worden voorbeelden gegeven van twee contexten waarin fosforylering van eiwitten en dus activering van signaalroutes tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren moet worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11,5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken – zowel primaire³² als vereeuwigde³³ . Bij E11.5 zijn de maxillaire processen in het proces van versmelting met de laterale en mediale nasale processen¹, waardoor een kritisch tijdspunt wordt weergegeven tijdens de craniofaciale ontwikkeling van de muis. Verder werden hier maxillaire processen en cellen afgeleid van de palatale planken gekozen omdat de laatste structuren derivaten zijn van de eerste, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om eiwitfosforylatie in vivo es in vitro in gerelateerde contexten te ondervragen. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve gezichtsprocessen en ontwikkelingstijdpunten.

Een cruciaal probleem bij het bestuderen van gefosforyleerde eiwitten is dat ze gemakkelijk worden gedefosforyleerd tijdens eiwitisolatie door overvloedige omgevingsfosfatasen. Om deze barrière te overwinnen, worden aanpassingen en aanpassingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van gefosforyleerde eiwitten mogelijk maken. Daarnaast worden best practices gegeven voor een goede analyse en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of muriene genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende signaalroutes die actief zijn tijdens de craniofaciale ontwikkeling.