Infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection
Summary
Cette méthodologie, qui comprenait l’alimentation par voie orale et l’infection par injection intrathoracique, pourrait évaluer efficacement l’influence des barrières de l’intestin moyen et / ou des glandes salivaires sur l’infection à arbovirus.
Abstract
Les virus transmis par les moustiques (MBV), qui sont des agents pathogènes infectieux pour les vertébrés, sont propagés par de nombreuses espèces de moustiques, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique. Une fois ingérés, les virus doivent surmonter la barrière de l’intestin moyen des moustiques pour atteindre l’hémolymphe, d’où ils pourraient potentiellement se propager aux glandes salivaires. Lorsqu’un moustique pique, ces virus se propagent à de nouveaux hôtes vertébrés. De même, le moustique peut attraper différents virus. En général, seule une infime partie des virus peut pénétrer dans les glandes salivaires par l’intestin. L’efficacité de transmission de ces virus aux glandes est affectée par les deux barrières physiques trouvées chez différentes espèces de moustiques: les barrières de l’intestin moyen et les barrières des glandes salivaires. Ce protocole présente une méthode de détection du virus dans les glandes salivaires d’Aedes aegypti après une infection par voie orale et par injection intrathoracique. De plus, déterminer si les intestins et/ou les glandes salivaires entravent la propagation virale peut aider à évaluer les risques de MBV transmis par Aedes aegypti.
Introduction
Les virus transmis par les moustiques (MBV), un groupe hétérogène de virus à ARN, peuvent persister chez les moustiques vecteurs et se propager ensuite aux hôtes vertébrés1. Les MBV cliniquement importants sont principalement répartis dans quatre familles de virus, à savoir Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae et Peribunyavividae 2,3. Au cours des dernières décennies, ces virus ont été signalés partout dans le monde, causant des problèmes de santé publique. En tant que l’un des MBV les plus connus, le virus de la dengue (DENV) est devenu l’arbovirus émergent ou ré-émergent le plus répandu dans plus de 100 pays au cours des 20 dernières années4. Depuis la découverte du virus Zika (ZIKV) à l’intérieur des terres, presque tous les pays et territoires tropicaux et subtropicaux du continent ont signalé des infections humaines par le ZIKV5. Afin d’évaluer le risque de transmission du virus, de nombreuses études menées ces dernières années ont porté sur la compétence des moustiques vecteurs pour ces virus 6,7. Par conséquent, il est essentiel de prévenir et de contrôler efficacement les maladies à transmission vectorielle.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), l’un des moustiques les plus faciles à élever en laboratoire, est un vecteur important du DENV, du ZIKV, du virus Chikungunya (CHIKV) et du virus de la fièvre jaune (YFV)8. Pendant longtemps, Ae. aegypti n’a été trouvé que sur le continent africain et en Asie du Sud-Est, mais ces dernières années, il a colonisé presque tous les continents9. En outre, l’abondance mondiale d’Ae. aegypti n’a cessé de croître, avec une augmentation estimée à 20% d’ici la fin du siècle10. De 2004 à 2009 en Chine, il y a eu une augmentation évidente de la compétence du vecteur Ae. aegypti pour le DENV en raison des températures quotidiennes plus élevées11. Le statut d’Ae. aegypti en tant que vecteur pathogène a considérablement augmenté en Chine. Par conséquent, pour relever ces défis, il est nécessaire d’étudier la compétence vectorielle des Ae. aegypti pour transmettre des virus.
En tant qu’arthropode hématophage, le moustique femelle perce la peau d’un hôte vertébré et se nourrit du sang. Les moustiques acquièrent parfois des virus auprès d’hôtes infectés par des virus, puis transfèrent les virus à un nouvel hôte. Ainsi, pour déterminer la compétence des vecteurs, les moustiques sont nourris avec une farine de sang artificielle contenant des arbovirus grâce à un système d’alimentation en laboratoire12. Les moustiques individuels sont séparés en têtes, corps et sécrétions de salive plusieurs jours après l’infection. Pour mesurer les taux d’infection, de dissémination et de transmission du virus, les titres de virus ont été détectés par PCR quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) ou dosage de plaque. Cependant, tous les moustiques ne développent pas d’infections de l’intestin moyen et la capacité de transférer un virus à l’hôte suivant après l’alimentation par le sang. Il est lié aux barrières physiologiques des moustiques, qui empêchent les agents pathogènes de pénétrer dans le corps et jouent un rôle essentiel dans leur immunité innée13. Les barrières de l’intestin moyen, en particulier la barrière d’infection de l’intestin moyen (MIB) et la barrière de fuite de l’intestin moyen (MEB), influencent si le virus pourrait infecter le vecteur par voie systémique et l’efficacité avec laquelle il se propage. Il entrave l’analyse de l’infection d’autres tissus, tels que les glandes salivaires qui présentent également une infection des glandes salivaires et échappentaux barrières 13,14. Pour mieux caractériser l’infection de l’intestin moyen et des glandes salivaires chez le vecteur, un protocole détaillé pour l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique de l’arbovirus chez Ae. aegypti est présenté ici. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que l’infection par le DENV et le ZIKV chez Aedes spp., et pourrait s’avérer une procédure pratique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de cette méthode était de fournir une évaluation complète des risques d’un virus transmis par les moustiques en évaluant la compétence des vecteurs par l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique.
Dans l’expérience d’alimentation orale, les moustiques engorgés doivent être choisis et transférés dans un nouveau conteneur, ce qui pose un risque grave pour les opérateurs. La raison en est que tout moustique, y compris les moustiques non infectés, pour…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Referencias
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