Summary

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Published: April 21, 2022
doi:

Summary

Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).

Abstract

Os avanços nas ferramentas de imagem oftálmica oferecem um nível sem precedentes de acesso a pesquisadores que trabalham com modelos animais de lesão neurovascular. Para alavancar adequadamente essa maior traduzibilidade, há uma necessidade de conceber métodos reprodutíveis de extrair dados quantitativos dessas imagens. A tomografia de coerência óptica (OCT) pode resolver a histologia da retina na resolução de micrômetros e revelar diferenças funcionais no fluxo sanguíneo vascular. Aqui, delineamos leituras vasculares não invasivas que usamos para caracterizar o dano patológico pós-insulto vascular em um modelo otimizado de oclusão da veia retiniana (RVO) em camundongos. Essas leituras incluem análise de imagens ao vivo da morfologia da retina, desorganização das camadas internas da retina (DRIL) medida de isquemia capilar e medidas de angiografia fluoresceína de edema retiniano e densidade vascular. Essas técnicas correspondem diretamente àquelas usadas para examinar pacientes com doença da retina na clínica. A padronização desses métodos permite a comparação direta e reprodutível de modelos animais com fenótipos clínicos de doença oftálmica, aumentando o poder translacional dos modelos de lesão vascular.

Introduction

A doença neurovascular é um importante problema de saúde responsável por acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, uma das principais causas de mortalidade e morbidade, e doenças vasculares da retina que levam à perda de visão 1,2. Para modelar a doença neurovascular, empregamos um modelo de camundongo de oclusão da veia retiniana (RVO). Este modelo não é invasivo e utiliza técnicas de imagem in vivo semelhantes àquelas usadas para examinar pessoas com doença vascular da retina em um ambiente clínico. A utilização desse modelo aumenta, assim, o potencial translacional dos estudos que utilizam esse modelo. Tal como acontece com todos os modelos de mouse, é fundamental maximizar a reprodutibilidade do modelo.

As doenças vasculares da retina são uma das principais causas de perda de visão em pessoas com menos de 70 anos. A RVO é a segunda doença vascular retiniana mais comum depois da retinopatia diabética3. As características clínicas características da OVR incluem lesão isquêmica, edema de retina e perda de visão como consequência da perda neuronal 3,4. Modelos de RVO em camundongos utilizando fotocoagulação a laser de vasos importantes foram desenvolvidos e refinados para replicar as principais patologias clínicas observadas no RVO humano 5,6,7. Os avanços na imagem oftálmica também permitem a replicação de ferramentas diagnósticas não invasivas utilizadas em humanos, a saber, a angiografia fluoresceína (AF) e a tomografia de coerência óptica (OCT)6. A Angiografia por Fluoresceína permite a observação de vazamentos devido à quebra da barreira sangue-retina (BRB), bem como a dinâmica do fluxo sanguíneo na retina, incluindo locais de oclusão, utilizando a injeção de fluoresceína, um pequeno corante fluorescente 8,9. A OCT permite a aquisição de imagens transversais de alta resolução da retina e o estudo da espessura e organização das camadas retinianas10. A análise de imagens de AF tem sido historicamente em grande parte qualitativa, o que limita o potencial de comparação direta e reprodutível entre os estudos. Recentemente, vários métodos têm sido desenvolvidos para a quantificação da espessura da camada em imagens de OCT, embora atualmente não exista um protocolo de análise padronizado e o local de aquisição da imagem da OCT varie11. Para aproveitar adequadamente essas ferramentas, é necessária uma metodologia de análise de dados padronizada, quantitativa e replicável. Neste trabalho, apresentamos três dessas leituras vasculares utilizadas para avaliar o dano patológico em um modelo de camundongo de vazamento de RVO-fluoresceína, espessura da camada OCT e desorganização das camadas retinianas.

Protocol

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia. NOTA: A imagem foi feita em camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade que pesavam aproximadamente 23 g. 1. Preparação de reagentes para imagens da retin…

Representative Results

Esses métodos de análise permitem a quantificação da patologia da retina capturada por imagens de AF e OCT. Os experimentos dos quais os dados representativos são extraídos usaram camundongos machos C57BL/6J que serviram como controles não feridos ou foram submetidos ao procedimento RVO e receberam colírios de tratamento Pen1-XBir3 ou colírios de veículo Pen1-Saline. O modelo de lesão RVO envolveu a irradiação a laser (532 nm) das veias principais em cada olho de um rato anestesiado após uma injeção na ve…

Discussion

A imagem não invasiva da retina de roedores apresenta uma via para estudar a patologia e desenvolver intervenções. Estudos prévios desenvolveram e otimizaram um modelo de RVO em camundongos, limitando a variabilidade e permitindo a tradução confiável de patologias clínicas comuns na retina murina 5,7,13. Os desenvolvimentos na tecnologia de imagem oftálmica permitem ainda o uso de técnicas clínicas de imagem in vi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE – 1644869 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT) e o Departamento de Defesa Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).

Materials

AK-Fluor 10% Akorn NDC: 17478-253-10 light-sensitive
Carprofen Rimadyl NADA #141-199 keep at 4 °C
GenTeal Alcon 00658 06401
Image J NIH
InSight 2D Phoenix Technology Group OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine Akorn NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV Phoenix Technology Group Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module Phoenix Technology Group Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module Phoenix Technology Group OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module Phoenix Technology Group Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop Adobe
Refresh Allergan 94170
Tropicamide Akorn NDC: 174478-102-12
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

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Chen, C. W., Potenski, A. M., Colón Ortiz, C. K., Avrutsky, M. I., Troy, C. M. In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility. J. Vis. Exp. (182), e63782, doi:10.3791/63782 (2022).

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