Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut
Summary
Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt Isolationsmethoden, Kultivierungsbedingungen und Charakterisierung menschlicher Primärzellen mit hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit unter Verwendung einer schnellen enzymatischen Dissoziation der Haut. Primäre Keratinozyten, Fibroblasten und Schwann-Zellen werden alle aus der menschlichen neugeborenen Vorhaut gewonnen, die nach Standardbehandlungen verfügbar ist. Die entfernte Haut wird desinfiziert und das Unterhautfett und der Muskel werden mit einem Skalpell entfernt. Die Methode besteht aus einer enzymatischen und mechanischen Trennung von epidermalen und dermalen Schichten, gefolgt von einer zusätzlichen enzymatischen Verdauung, um Einzelzellsuspensionen aus jeder dieser Hautschichten zu erhalten. Schließlich werden einzelne Zellen in geeigneten Zellkulturmedien nach Standard-Zellkulturprotokollen gezüchtet, um das Wachstum und die Lebensfähigkeit über Wochen aufrechtzuerhalten. Zusammen ermöglicht dieses einfache Protokoll die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung aller drei Zelltypen aus einem einzigen Stück Haut für die In-vitro-Bewertung von Haut-Nerven-Modellen. Darüber hinaus können diese Zellen zusammen in Kokulturen verwendet werden, um ihre Auswirkungen aufeinander und ihre Reaktionen auf In-vitro-Traumata in Form von Kratzern, die roboterhaft in der mit der Wundheilung verbundenen Kultur durchgeführt werden, zu messen.
Introduction
Primärzellen, die aus lebendem Gewebe gewonnen und unter In-vitro-Bedingungen kultiviert werden, ähneln stark dem physiologischen Zustand 1 und sind damit ein ideales Modell für die Untersuchung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse. Die Haut enthält mehrere Zelltypen, darunter Keratinozyten, Fibroblasten, Sebozyten, Melanozyten und Schwann-Zellen (SCs), die für In-vitro-Experimente isoliert und kultiviert werden können. Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Keratinozyten, Fibroblasten und SCs aus einem einzigen Stück Haut wurden nicht beschrieben. Das Ziel dieses Protokolls ist zweifach: 1) eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Kultivierung von dermalen SCs zu etablieren und 2) eine effiziente, robuste Methode zur Isolierung von Keratinozyten, Fibroblasten und SCs aus einer einzigen menschlichen Vorhaut zu verwenden.
Derzeit gibt es etablierte Protokolle zur Isolierung der Hautkeratinozyten 2,3,4 und der Fibroblasten 5,6. Diese Studien beschreiben die Isolierung von Keratinozyten, Fibroblasten oder beiden aus der Haut, aber kein Protokoll befasst sich mit der Etablierung von Kulturen primärer SCs aus der menschlichen Haut. Neuere Studien deuten darauf hin, dass neuronale SCs Keratinozyten- und Fibroblastenzellprozesse modulieren und normale physiologische Hautfunktionen regulieren7. SCs sind daher entscheidend für die Hauthomöostase und tragen wesentlich zur regulierenden Physiologie bei, die das Verhalten benachbarter Hautzelltypen beeinflusst8. Daher ist ein Protokoll, das die Isolierung jedes dieser Zelltypen ermöglicht, ideal für In-vitro-Experimente mit Zell-Zell-Kommunikation oder Cross-Talk zwischen Zelltypen.
Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung einzelner Zellkulturen von Primärzellen aus einem einzigen Stück Haut. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn die Menge an verfügbarem Gewebe begrenzt ist. Darüber hinaus ermöglicht die Isolierung aller drei Zelltypen von einem einzigen Spender robuste Vergleiche zwischen Zelltypen oder Kokulturexperimenten und mildert gleichzeitig den Einfluss der Genetik während des gewünschten Experiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um drei verschiedene Zellpopulationen aus einem einzigen Stück der Vorhaut zu isolieren, nämlich Keratinozyten, Fibroblasten und Schwann-Zellen. Es gibt einige Isolationsprotokolle, um Keratinozyten und Fibroblasten 2,3,5,6 zu isolieren, aber keines beschreibt die SC-Isolierung. Abgesehen von den wichtigsten Strukturzellen in Haut, Keratinozyten und …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten uns bei Dr. Fadia Kamal und Dr. Reyad Elbarbary dafür bedanken, dass sie uns den Einsatz von Laborinstrumenten und technischem Support ermöglicht haben. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH (K08 AR060164-01A) und des DOD (W81XWH-16-1-0725) an J. C. E. sowie durch institutionelle Unterstützung des Pennsylvania State University Hershey Medical Center unterstützt.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
Referencias
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
