Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) foi desenvolvida para resolver a estrutura tridimensional (3D) de proteínas em seu estado natal 1,2,3,4. A técnica envolve a fixação de proteínas em uma camada fina (10-100 nm) de gelo vítreo e a aquisição de imagens de projeção de proteínas orientadas aleatoriamente usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM), com a amostra mantida à temperatura de nitrogênio líquido. Milhares a milhões de imagens de projeção são adquiridas e usadas para reconstruir uma estrutura 3D da proteína por algoritmos computacionais ^5,6. Para uma análise bem-sucedida com crio-EM, a preparação crio-amostra foi automatizada por meio do congelamento do equipamento que controla as condições de mancha, umidade e temperatura. A solução amostral é carregada em uma grade TEM com uma membrana de carbono furada, sucessivamente borrada para remover a solução em excesso, e, em seguida, mergulha-congelada com etano líquido para produzir gelo fino e vítreo ^1,5,6. Com os avanços da crio-EM e a automação da preparação da amostra⁷, a crio-EM tem sido cada vez mais utilizada para resolver a estrutura de proteínas, incluindo proteínas envelope para vírus e proteínas do canal de íons na membrana celular ^8,9,10. A estrutura das proteínas envelope de partículas virais patogênicas é importante para a compreensão da patologia da infecção viral, bem como para o desenvolvimento do sistema de diagnóstico e vacinas, por exemplo, SARS-CoV-2¹¹, que causou a pandemia COVID-19. Além disso, técnicas crio-EM foram recentemente aplicadas às ciências materiais, como para materiais sensíveis ao feixe de imagem utilizados na bateria ^12,13,14 e sistemas catalíticos ^14,15 e análise da estrutura de materiais inorgânicos em estado de solução¹⁶.

Apesar dos desenvolvimentos perceptíveis em crio-EM e técnicas relevantes, existem limitações na preparação da criom amostra, dificultando a análise da estrutura 3D de alto rendimento. Preparar um filme de gelo vítreo com espessura ideal é especialmente importante para a obtenção da estrutura 3D de materiais biológicos com resolução atômica. O gelo deve ser fino o suficiente para minimizar o ruído de fundo de elétrons espalhados pelo gelo e proibir sobreposições de biomoléculas ao longo do caminho^do feixe de elétrons ^1,17. No entanto, se o gelo é muito fino, pode fazer com que moléculas de proteínas se alinhem em orientações preferenciais ou desnaturais 18,19,20. Portanto, a espessura do gelo vítreo deve ser otimizada dependendo do tamanho do material de interesse. Além disso, um esforço extensivo é normalmente necessário para a preparação da amostra e a triagem manual da integridade do gelo e da proteína nas grades TEM preparadas. Esse processo é extremamente demorado, o que dificulta sua eficiência para análise de estrutura 3D de alto rendimento. Portanto, melhorias na confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM aumentariam a utilização da crio-EM na biologia estrutural e na descoberta de medicamentos comerciais, bem como na ciência material.

Aqui, introduzimos processos de microfabização para a fabricação de um chip micro-padronizado com janelas de óxido de grafeno (GO) projetados para crio-EM de alta produtividade com espessura de gelo controlada²¹. O chip micro-padronizado foi fabricado usando técnicas de sistema microeletromecânico (MEMS), que podem manipular a estrutura e as dimensões do chip dependendo dos propósitos de imagem. O chip micro-padronizado com janelas GO tem uma estrutura de microwell que pode ser preenchida com a solução de amostra, e a profundidade da microwell pode ser regulada para controlar a espessura do gelo vítreo. A forte afinidade do GO com as biomoléculas aumenta a concentração de biomoléculas para visualização, melhorando a eficiência da análise da estrutura. Além disso, o chip micro-padronizado é composto por um quadro Si, que proporciona alta estabilidade mecânica para a grade¹⁹, tornando-o ideal para manusear o chip durante os procedimentos de preparação da amostra e imagens crio-EM. Portanto, um chip micro-padronizado com janelas GO fabricadas por técnicas MEMS fornece confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM, que pode permitir uma análise eficiente e de estrutura de alto rendimento com base no crio-EM.