Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit kontrollierter Dicke für die kryogene Elektronenmikroskopie mit hohem Durchsatz

Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) wurde entwickelt, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Proteinen in ihrem nativen Zustand 1,2,3,4 aufzulösen. Die Technik beinhaltet das Fixieren von Proteinen in einer dünnen Schicht (10-100 nm) aus Glaseis und das Aufnehmen von Projektionsbildern von zufällig orientierten Proteinen mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), wobei die Probe bei flüssiger Stickstofftemperatur gehalten wird. Tausende bis Millionen von Projektionsbildern werden aufgenommen und verwendet, um eine 3D-Struktur des Proteins durch Rechenalgorithmen ^5,6 zu rekonstruieren. Für eine erfolgreiche Analyse mit Kryo-EM wurde die Kryoprobenvorbereitung automatisiert, indem die Ausrüstung, die die Löschbedingungen, die Feuchtigkeit und die Temperatur steuert, eingefroren wurde. Die Probenlösung wird mit einer löchrigen Kohlenstoffmembran in ein TEM-Gitter geladen, nacheinander getupft, um die überschüssige Lösung zu entfernen, und dann mit flüssigem Ethan eingefroren, um dünnes, glasiges Eis ^1,5,6 zu erzeugen. Mit den Fortschritten in der Kryo-EM und der Automatisierung der Probenvorbereitung⁷ wurde Kryo-EM zunehmend verwendet, um die Struktur von Proteinen zu lösen, einschließlich Hüllproteinen für Viren und Ionenkanalproteinen in der Zellmembran^8,9,10. Die Struktur der Hüllproteine pathogener Viruspartikel ist wichtig für das Verständnis der Virusinfektionspathologie sowie für die Entwicklung des Diagnosesystems und der Impfstoffe, z. B. SARS-CoV-2 11, die die^{COVID-19-Pandemie} verursacht haben. Darüber hinaus wurden Kryo-EM-Techniken in jüngster Zeit in den Materialwissenschaften angewendet, z. B. für die Abbildung strahlempfindlicher Materialien, die in Batterien 12,13,14 und katalytischen Systemen^14,15 verwendet werden^, und für die Analyse der Struktur anorganischer Materialien im Lösungszustand ¹⁶.

Trotz spürbarer Entwicklungen in der Kryo-EM und relevanten Techniken gibt es Einschränkungen in der Kryoprobenvorbereitung, die die Hochdurchsatz-3D-Strukturanalyse behindern. Die Herstellung eines glasigen Eisfilms mit optimaler Dicke ist besonders wichtig, um die 3D-Struktur biologischer Materialien mit atomarer Auflösung zu erhalten. Das Eis muss dünn genug sein, um Hintergrundgeräusche von Elektronen, die vom Eis gestreut werden, zu minimieren und Überlappungen von Biomolekülen entlang des Elektronenstrahlweges ^1,17 zu verbieten. Wenn das Eis jedoch zu dünn ist, kann dies dazu führen, dass sich Proteinmoleküle in bevorzugten Orientierungen ausrichten oder^{denaturieren 18,19,20}. Daher sollte die Dicke des Glaseises in Abhängigkeit von der Größe des interessierenden Materials optimiert werden. Darüber hinaus ist in der Regel ein umfangreicher Aufwand für die Probenvorbereitung und das manuelle Screening der Eis- und Proteinintegrität auf den vorbereiteten TEM-Gittern erforderlich. Dieser Prozess ist extrem zeitaufwendig, was seine Effizienz für die 3D-Strukturanalyse mit hohem Durchsatz beeinträchtigt. Daher würden Verbesserungen der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Kryo-EM-Probenvorbereitung den Einsatz von Kryo-EM in der Strukturbiologie und kommerziellen Arzneimittelforschung sowie in der Materialwissenschaft verbessern.

Hierin stellen wir Mikrofabrikationsprozesse zur Herstellung eines mikrostrukturierten Chips mit Graphenoxid (GO) -Fenstern vor, die für Kryo-EM mit hohem Durchsatz mit kontrollierter Eisdicke²¹ ausgelegt sind. Der mikrostrukturierte Chip wurde mit mikroelektromechanischen Systemtechniken (MEMS) hergestellt, die die Struktur und Abmessungen des Chips in Abhängigkeit von den Bildgebungszwecken manipulieren können. Der mikrostrukturierte Chip mit GO-Fenstern hat eine Mikrowellenstruktur, die mit der Probenlösung gefüllt werden kann, und die Tiefe der Mikrovertiefung kann reguliert werden, um die Dicke des Glaseises zu kontrollieren. Die starke Affinität von GO für Biomoleküle erhöht die Konzentration von Biomolekülen für die Visualisierung und verbessert die Effizienz der Strukturanalyse. Darüber hinaus besteht der mikrostrukturierte Chip aus einem Si-Rahmen, der eine hohe mechanische Stabilität für das Gitter¹⁹ bietet, was ihn ideal für die Handhabung des Chips während der Probenvorbereitung und der Kryo-EM-Bildgebung macht. Daher bietet ein mikrostrukturierter Chip mit GO-Fenstern, der mit MEMS-Techniken hergestellt wird, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Kryo-EM-Probenvorbereitung, die eine effiziente und hochdurchsatzbasierte Strukturanalyse auf der Grundlage von Kryo-EM ermöglichen kann.