Fabrication d’une puce à micro-motifs avec épaisseur contrôlée pour la microscopie électronique cryogénique à haut débit

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) a été développée pour résoudre la structure tridimensionnelle (3D) des protéines dans leur état natif 1,2,3,4. La technique consiste à fixer des protéines dans une fine couche (10-100 nm) de glace vitrée et à acquérir des images de projection de protéines orientées aléatoirement à l’aide d’un microscope électronique à transmission (TEM), l’échantillon étant maintenu à la température de l’azote liquide. Des milliers à des millions d’images de projection sont acquises et utilisées pour reconstruire une structure 3D de la protéine par des algorithmes de calcul ^5,6. Pour une analyse réussie avec cryo-EM, la préparation des cryo-échantillons a été automatisée en gelant l’équipement qui contrôle les conditions de buvardage, l’humidité et la température. La solution d’échantillon est chargée sur une grille TEM avec une membrane de carbone trouée, successivement effacée pour éliminer l’excès de solution, puis congelée avec de l’éthane liquide pour produire de la glace mince et vitreuse ^1,5,6. Avec les progrès de la cryo-EM et l’automatisation de la préparation des échantillons⁷, la cryo-EM a été de plus en plus utilisée pour résoudre la structure des protéines, y compris les protéines d’enveloppe pour les virus et les protéines des canaux ioniques dans la membrane cellulaire ^8,9,10. La structure des protéines d’enveloppe des particules virales pathogènes est importante pour comprendre la pathologie de l’infection virale, ainsi que pour développer le système de diagnostic et les vaccins, par exemple le SRAS-CoV-2¹¹, qui a causé la pandémie de COVID-19. De plus, les techniques cryo-EM ont récemment été appliquées aux sciences des matériaux, telles que l’imagerie de matériaux sensibles aux faisceaux utilisés dans les batteries ^12,13,14 et les systèmes catalytiques ^14,15 et l’analyse de la structure des matériaux inorganiques à l’état de solution¹⁶.

Malgré les développements notables de la cryo-EM et des techniques pertinentes, il existe des limites dans la préparation des cryo-échantillons, ce qui entrave l’analyse de la structure 3D à haut débit. La préparation d’un film de glace vitreux avec une épaisseur optimale est particulièrement importante pour obtenir la structure 3D de matériaux biologiques à résolution atomique. La glace doit être suffisamment mince pour minimiser le bruit de fond des électrons dispersés par la glace et pour interdire les chevauchements de biomolécules le long du trajet du faisceau ^{d’électrons 1,17}. Cependant, si la glace est trop mince, elle peut entraîner l’alignement des molécules de protéines dans les orientations préférées ou dénaturer 18,19,20. Par conséquent, l’épaisseur de la glace vitreuse doit être optimisée en fonction de la taille du matériau d’intérêt. De plus, des efforts considérables sont généralement nécessaires pour la préparation des échantillons et le criblage manuel de l’intégrité de la glace et des protéines sur les grilles TEM préparées. Ce processus prend énormément de temps, ce qui nuit à son efficacité pour l’analyse de structure 3D à haut débit. Par conséquent, l’amélioration de la fiabilité et de la reproductibilité de la préparation des échantillons cryo-EM améliorerait l’utilisation de la cryo-EM en biologie structurale et en découverte commerciale de médicaments, ainsi que pour la science des matériaux.

Ici, nous présentons des procédés de microfabrication pour la fabrication d’une puce à micro-motifs avec des fenêtres en oxyde de graphène (GO) conçues pour le cryo-EM à haut débit avec une épaisseur de glace contrôlée²¹. La puce à micro-motifs a été fabriquée à l’aide de techniques de système microélectromécanique (MEMS), qui peuvent manipuler la structure et les dimensions de la puce en fonction des objectifs d’imagerie. La puce à micro-motifs avec fenêtres GO a une structure de micropuit qui peut être remplie avec la solution d’échantillon, et la profondeur du micropuit peut être régulée pour contrôler l’épaisseur de la glace vitrée. La forte affinité de GO pour les biomolécules augmente la concentration de biomolécules pour la visualisation, améliorant ainsi l’efficacité de l’analyse de structure. En outre, la puce à micro-motifs est composée d’un cadre En Si, qui offre une grande stabilité mécanique à la grille¹⁹, ce qui la rend idéale pour la manipulation de la puce lors des procédures de préparation des échantillons et de l’imagerie cryo-EM. Par conséquent, une puce à micro-motifs avec des fenêtres GO fabriquées par des techniques MEMS assure la fiabilité et la reproductibilité de la préparation des échantillons cryo-EM, ce qui peut permettre une analyse de structure efficace et à haut débit basée sur cryo-EM.