Внутренняя чувствительность митохондриальной мембраны к Na⁺ раскрывает частично сегментированные функциональные пулы CoQ

Митохондриальная система окислительного фосфорилирования (OXPHOS) является основным путем, стимулирующим синтез аденозинтрифосфата (АТФ), производство активных форм кислорода (АФК) и потребление митохондриями восстановительных эквивалентов, таких как никотинамидадениндинуклеотид (NADH) или сукцинат. Система OXPHOS состоит из пяти белковых комплексов: комплекс I (CI) окисляет NADH и восстанавливает CoQ в убихинол (CoQH₂). Комплекс II (CII) окисляет сукцинат в фумарат и восстанавливает CoQ до CoQH₂. Комплекс III (CIII) окисляет CoQH₂ обратно в CoQ, уменьшая цитохром c (cyt c). Наконец, комплекс IV (CIV) окисляет цист c и уменьшает содержание кислорода в воде. Эта цепь оксидоредукции, так называемая цепь переноса электронов (mETC), связана с перекачкой H⁺ через ИММ, что создает электрохимический градиент, используемый комплексом V (CV) для фосфорилирования аденозиндифосфата (АДФ) в АТФ.

Комплексы mETC могут быть либо одиночными в IMM, либо собираться в четвертичные структуры, называемые суперкомплексами. CIV может собираться с CIII, образуя III₂+IV или Q-респирасому (так как она способна вдыхаться в присутствии CoQH₂)^1,2,3 или образуя гомодимеры или гомолигомеры 4. CIII может взаимодействовать с CI, образуя суперкомплекс I+III₂⁵. Наконец, CI также способен взаимодействовать с Q-респирасомой, создавая I+III₂+IV или N-респирасому (так как она может вдыхаться, потребляя NADH)1,6,7,8,9,10.

CoQ и cyt c являются подвижными носителями электронов, отвечающими за перенос электронов из CI/CII в CIII и из CIII в CIV, соответственно. Вопрос о том, налагают ли суперкомплексы функциональное локальное ограничение для этих носителей, был предметом интенсивных дебатов в течение последних двух десятилетий ^{2,7,11,12,13,14,15,16,17}. Тем не менее, несколько независимых групп продемонстрировали, что CoQ и cyt c могут быть функционально сегментированы в пулы в IMM. В отношении CoQ он может быть функционально сегментирован в определенный пул CoQ для CI (CoQ^NAD) и другой пул, предназначенный для FAD-зависимых ферментов (CoQ^FAD)1,7,12,18,19. Однако для того, чтобы дифференцировать существование частично сегментированных функциональных пулов CoQ, потребовалась сверхэкспрессия альтернативной оксидазы (AOX) и генерация специфических мутантов мтДНК, которые могут собирать CI в отсутствие CIII, ^1,19,20.

Механизм производства активных форм кислорода (АФК) во время гипоксии был неизвестен до недавнего времени. При острой гипоксии ДИ претерпевает активный/деактивный (A/D) переход, который включает в себя снижение его H⁺ , перекачивающей NADH-CoQ оксидоредуктазы. Такое снижение накачки H⁺ подкисляет митохондриальный матрикс и частично растворяет кальциево-фосфатные осадки в митохондриальном матриксе, высвобождая растворимый Ca²⁺. Это увеличение растворимого Ca²⁺ активирует теплообменник Na⁺/Ca²⁺ (NCLX), который выдавливает Ca²⁺ в обмен на Na⁺. Митохондриальное увеличение Na⁺ взаимодействует с фосфолипидами во внутренней части ИММ, уменьшая его текучесть и перенос CoQ между CII и CIII, в конечном итоге производя супероксидный анион, окислительно-восстановительный сигнал²¹. Интересно, что перенос CoQ был уменьшен только между CII и CIII, но не между CI и CIII, подчеркивая, что 1) Na⁺ смог модулировать только один из существующих пулов CoQ в митохондриях; 2) в IMM существуют функционально дифференцированные пулы CoQ. Таким образом, широко используемый протокол для изучения активности митохондриальных ферментов может быть использован для оценки существования упомянутых пулов CoQ.

Текущий протокол основан на измерении восстановления окисленной циты c, субстрата CIII, путем поглощения в присутствии сукцината (т.е. субстрата CII) или NADH (т.е. субстрата CI). Один и тот же образец делится на два, один из которых будет обработан KCl, а другой с одинаковой концентрацией NaCl. Таким образом, учитывая, что Na⁺ уменьшает текучесть ИММ, если бы CoQ существовал в уникальном пуле в IMM, как CI+CIII, так и CII+CIII уменьшались бы в присутствии Na⁺. Однако, если бы CoQ существовал в частично сегментированных функциональных пулах CoQ, влияние Na⁺ было бы в основном (или только) очевидно на активность CII+CIII, но не на CI+CIII. Как недавно опубликовано²¹, Na⁺ влияет только на перенос CoQ между CII и CIII (рисунок 1C,D), но не между CI и CIII (рисунок 1A,B).

Этот протокол вместе с целым рядом методов был использован для подтверждения существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ в IMM, один из которых посвящен CI (т.е. CoQ^NAD), а другой – ферментам, связанным с FAD (т.е. CoQ^FAD)^1,3,7; замечание, которое, хотя оно и продолжает обсуждаться²², было независимо подтверждено несколькими группами ^7,19. Таким образом, суперсборка CI в суперкомплексы влияет на локальную мобильность CoQ, облегчая его использование CIII в рамках суперкомплекса 1,7,13,14,23,24,25.