La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na⁺ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

Il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è la principale via che guida la sintesi dell’adenosina trifosfato (ATP), la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e il consumo di equivalenti riducenti, come nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) o succinato, da parte dei mitocondri. Il sistema OXPHOS è composto da cinque complessi proteici: il Complesso I (CI) ossida il NADH e riduce il CoQ in ubichinolo (CoQH₂). Il Complesso II (CII) ossida il succinato in fumarato e riduce il CoQ in CoQH₂. Il Complesso III (CIII) ossida nuovamente il CoQH₂ in CoQ, riducendo il citocromo c (cyt c). Infine, il complesso IV (CIV) ossida cyt c e riduce l’ossigeno in acqua. Questa catena di ossidoriduzione, la cosiddetta catena di trasporto degli elettroni (mETC), è accoppiata al pompaggio di H ⁺ attraverso l’IMM, che crea un gradiente elettrochimico utilizzato dal complesso V (CV) per fosforilare l’adenosina difosfato (ADP) in ATP.

I complessi mETC possono essere soli nell’IMM o assemblarsi in strutture quaternarie chiamate supercomplessi. CIV può assemblarsi con CIII, formando il III₂+IV o Q-respirasome (in quanto è in grado di respirare in presenza di CoQH₂)^1,2,3 o formando omodimeri o omooligomeri⁴. CIII può interagire con CI, formando il supercomplesso I+III₂⁵. Infine, CI è anche in grado di interagire con il Q-respirasome, costruendo l’I+III₂+IV o N-respirasome (in quanto può respirare consumando NADH)^1,6,7,8,9,10.

CoQ e cyt c sono portatori mobili di elettroni incaricati di trasferire elettroni da CI/CII a CIII e da CIII a CIV, rispettivamente. Se i supercomplessi impongano o meno una restrizione locale funzionale per questi vettori è stato oggetto di intenso dibattito negli ultimi due decenni 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, diversi gruppi indipendenti hanno dimostrato che CoQ e cyt c possono essere segmentati funzionalmente in pool nell’IMM. Per quanto riguarda il CoQ, può essere segmentato funzionalmente in uno specifico pool di CoQ per CI (CoQ^NAD) e un altro pool dedicato agli enzimi FAD-dipendenti (CoQ^FAD)1,7,12,18,19. Tuttavia, al fine di differenziare l’esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, è stata richiesta la sovraespressione dell’ossidasi alternativa (AOX) e la generazione di specifici mutanti del mtDNA, che possono assemblare CI in assenza di CIII, ^1,19,20.

Il meccanismo di produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) durante l’ipossia era sconosciuto fino a poco tempo fa. In caso di ipossia acuta, l’IC subisce la transizione attiva/disattivativa (A/D), che comporta la diminuzione della sua attività di pompaggio H⁺ della NADH-CoQ ossidoreduttasi. Tale diminuzione del pompaggio H⁺ acidifica la matrice mitocondriale e dissolve parzialmente i precipitati calcio-fosfato nella matrice mitocondriale, rilasciando Ca²⁺ solubile. Questo aumento di Ca²⁺ solubile attiva lo scambiatore Na⁺/Ca²⁺ (NCLX), che estrude Ca²⁺ in cambio di Na⁺. L’aumento mitocondriale di Na⁺ interagisce con i fosfolipidi nel lato interno dell’IMM, diminuendone la fluidità e il trasferimento di CoQ tra CII e CIII, producendo infine anione superossido, un segnale redox²¹. È interessante notare che il trasferimento di CoQ è diminuito solo tra CII e CIII, ma non tra CI e CIII, evidenziando che 1) Na ⁺ è stato in grado di modulare solo uno dei pool coQ esistenti nei mitocondri; 2) esistono pool di CoQ funzionalmente differenziati nell’IMM. Pertanto, un protocollo ampiamente utilizzato per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali può essere utilizzato per valutare l’esistenza dei pool di CoQ menzionati.

L’attuale protocollo si basa sulla misura della riduzione del cyt c ossidato, il substrato del CIII, per assorbanza in presenza di succinato (cioè substrato CII) o NADH (cioè substrato CI). Lo stesso campione è diviso in due, uno dei quali sarà trattato con KCl e l’altro con la stessa concentrazione di NaCl. In questo modo, dato che Na⁺ diminuisce la fluidità IMM, se coQ esistesse in un pool unico nell’IMM, sia CI+CIII che CII+CIII diminuirebbero in presenza di Na⁺. Tuttavia, se il CoQ esistesse in pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, l’effetto di Na⁺ sarebbe per lo più (o solo) evidente sull’attività CII+CIII, ma non sull’IC+CIII. Come recentemente pubblicato²¹, Na⁺ influisce solo sul trasferimento di CoQ tra CII e CIII (Figura 1C,D), ma non tra CI e CIII (Figura 1A,B).

Questo protocollo, insieme a una panoplia di tecniche, è stato utilizzato per confermare l’esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati nell’IMM, uno dedicato all’IC (cioè CoQ^NAD) e un altro dedicato agli enzimi legati alla FAD (cioè CoQ^FAD)^1,3,7; un’osservazione che, sebbene continui ad essere discussa²², è stata corroborata indipendentemente da diversi gruppi ^7,19. Pertanto, il superassemblaggio di CI in supercomplessi influisce sulla mobilità locale del CoQ, facilitandone l’utilizzo da parte del CIII all’interno del supercomplesso ^{1,7,13,14,23,24,25}.