Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na ⁺ onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

Mitochondriaal oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) is de belangrijkste route die adenosinetrifosfaat (ATP) synthese, reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie en consumptie van reducerende equivalenten, zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) of succinaat, door mitochondriën aandrijft. OXPHOS-systeem bestaat uit vijf eiwitcomplexen: Complex I (CI) oxideert NADH en reduceert CoQ tot ubiquinol (CoQH₂). Complex II (CII) oxideert succinaat tot fumaraat en reduceert CoQ tot CoQH₂. Complex III (CIII) oxideert CoQH₂ terug tot CoQ, waardoor cytochroom c (cyt c) wordt verminderd. Ten slotte oxideert complex IV (CIV) cyt c en reduceert zuurstof tot water. Deze oxidoreductieketen, de zogenaamde elektronentransportketen (mETC), is gekoppeld aan het pompen van H⁺ over de IMM, waardoor een elektrochemische gradiënt ontstaat die door complex V (CV) wordt gebruikt om adenosinedifosfaat (ADP) in ATP te fosforyleren.

mETC-complexen kunnen alleen in de IMM zijn of zich samenvoegen tot quaternaire structuren die supercomplexen worden genoemd. CIV kan assembleren met CIII, waardoor het III₂+IV of Q-respirasoom ontstaat (omdat het kan ademen in aanwezigheid van CoQH₂)^1,2,3 of homodimeren of homooligomeren⁴ vormt. CIII kan interageren met CI en vormt het supercomplex I+III₂⁵. Ten slotte is CI ook in staat om te interageren met het Q-respirasoom, waarbij het I + III₂ + IV of N-respirasoom wordt gebouwd (omdat het kan ademen met NADH)1,6,7,8,9,10.

CoQ en cyt c zijn mobiele elektronendragers die verantwoordelijk zijn voor de overdracht van elektronen van CI/CII naar CIII en van CIII naar CIV. Of supercomplexen al dan niet een functionele lokale beperking opleggen voor deze dragers is de afgelopen twee decennia een kwestie van intens debat geweest 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Verschillende onafhankelijke groepen hebben echter aangetoond dat CoQ en cyt c functioneel kunnen worden gesegmenteerd in pools in de IMM. Met betrekking tot de CoQ kan het functioneel worden gesegmenteerd in een specifieke CoQ-pool voor CI (CoQ^NAD) en een andere pool gewijd aan FAD-afhankelijke enzymen (CoQ^FAD)1,7,12,18,19. Om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te differentiëren, waren echter de overexpressie van het alternatieve oxidase (AOX) en de generatie van specifieke mtDNA-mutanten, die CI kunnen assembleren in afwezigheid van CIII, vereist ^1,19,20.

Het mechanisme van reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie tijdens hypoxie was tot voor kort onbekend. Bij acute hypoxie ondergaat CI de actieve/deactieve (A/D) overgang, waarbij de H⁺ pompende NADH-CoQ oxidoreductase activiteit afneemt. Een dergelijke afname van H ⁺ pompen verzuurt de mitochondriale matrix en lost gedeeltelijk de calciumfosfaatprecipitaten op in de mitochondriale matrix, waardoor oplosbare Ca²⁺ vrijkomt. Deze toename van oplosbaar Ca²⁺ activeert de Na⁺/Ca²⁺ wisselaar (NCLX), die Ca²⁺ extrudeert in ruil voor Na⁺. Mitochondriale Na ⁺ -toename interageert met fosfolipiden in de binnenkant van de IMM, waardoor de vloeibaarheid en CoQ-overdracht tussen CII en CIII afnemen en uiteindelijk superoxide-anion wordt geproduceerd, een redoxsignaal²¹. Interessant is dat CoQ-overdracht alleen werd verminderd tussen CII en CIII, maar niet tussen CI en CIII, wat benadrukt dat 1) Na ⁺ in staat was om slechts één van de bestaande CoQ-pools in de mitochondriën te moduleren; 2) er bestaan functioneel gedifferentieerde CoQ-pools in de IMM. Zo kan een veelgebruikt protocol voor de studie van mitochondriale enzymactiviteiten worden gebruikt om het bestaan van de genoemde CoQ-pools te beoordelen.

Het huidige protocol is gebaseerd op de meting van de reductie van geoxideerde cyt c, het substraat van CIII, door absorptie in aanwezigheid van succinaat (d.w.z. CII-substraat) of NADH (d.w.z. CI-substraat). Hetzelfde monster is verdeeld in tweeën, waarvan er één zal worden behandeld met KCl en de andere met dezelfde concentratie NaCl. Op deze manier, gezien het feit dat Na ⁺ de IMM-vloeibaarheid vermindert, als CoQ in een unieke pool in de IMM zou bestaan, zouden zowel CI + CIII als CII + CIII afnemen in de aanwezigheid van Na ⁺. Als CoQ echter zou bestaan in gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools, zou het effect van Na⁺ meestal (of alleen) duidelijk zijn op de CII+CIII-activiteit, maar niet op de CI+CIII. Zoals onlangs gepubliceerd²¹, heeft Na⁺ alleen invloed op de CoQ-overdracht tussen CII en CIII (figuur 1C,D), maar niet tussen CI en CIII (figuur 1A,B).

Dit protocol, samen met een arsenaal aan technieken, is gebruikt om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools in de IMM te bevestigen, een gewijd aan CI (d.w.z. CoQ^NAD) en een andere gewijd aan FAD-gekoppelde enzymen (d.w.z. CoQ^FAD)^1,3,7; een constatering die, hoewel er nog steeds over^{wordt gedebatteerd 22}, onafhankelijk van elkaar is bevestigd door verschillende groepen ^7,19. De superassemblage van CI in supercomplexen heeft dus invloed op de lokale mobiliteit van CoQ, waardoor het gebruik ervan door de CIII binnen het supercomplex 1,7,13,14,23,24,25 wordt ^{vergemakkelijkt}.