Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

I mitocondri sono essenziali per mantenere la vitalità cellulare e svolgono numerose funzioni cellulari come il metabolismo energetico (vie metaboliche di glucosio, amminoacidi, lipidi e nucleotidi). Come sito primario della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), i mitocondri sono centrali in diversi processi di segnalazione cellulare come l’apoptosi e partecipano alla sintesi di cluster ferro-zolfo (Fe-S), all’importazione e alla maturazione delle proteine mitocondriali e al mantenimento del loro genoma e dei ribosomi ^1,2,3. La rete dinamica della membrana mitocondriale è controllata da processi di fusione e fissione e dispone anche di macchinari per il controllo di qualità e mitofagia ^4,5,6.

La disfunzione mitocondriale è associata alla comparsa di diverse condizioni patologiche come il cancro, il diabete e l’obesità⁷. Disturbi della funzione mitocondriale sono rilevati nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale, come nel morbo di Alzheimer ^8,9, nel morbo di Parkinson^10,11, nella sclerosi laterale amiotrofica^12,13 e nella malattia di Huntington ^14,15 . Nel sistema nervoso periferico, la perdita della funzione mitocondriale negli assoni è osservata nelle neuropatie immunitarie, come la sindrome di Guillain-Barré^16,17, e in associazione con un’elevata produzione di ROS mitocondriale negli assoni, questi eventi portano all’attivazione della MAP Chinasi nelle cellule di Schwann¹⁸. Ciò dimostra che la fisiologia mitocondriale può essere essenziale non solo per una cellula sito-specifica, ma per un intero tessuto. Nella polineuropatia sensoriale distale associata all’HIV (HIV-DSP), i mitocondri hanno un ruolo nel meccanismo attraverso il quale il trans-attivatore della proteina di trascrizione (HIV-TAT) consente all’HIV di replicarsi in modo efficiente, così come molti altri ruoli nella patogenesi dell’infezione da HIV^19,20.

La valutazione della fisiologia mitocondriale del nervo sciatico è emersa come un obiettivo essenziale per lo studio della neuropatia ^7,21,22. Nella neuropatia diabetica, le analisi proteomiche e metabolomiche suggeriscono che la maggior parte delle alterazioni molecolari nel diabete influenzano la fosforilazione ossidativa mitocondriale del nervo sciatico e il metabolismo lipidico⁷. Queste alterazioni sembrano anche essere i primi segni del diabete²¹ indotto dall’obesità. In un modello murino di neuropatia dolorosa indotta dalla chemioterapia, la compromissione mitocondriale nel nervo sciatico viene rilevata come una diminuzione della fosforilazione ossidativa²² e una riduzione delle attività dei complessi mitocondriali, del potenziale di membrana e del contenuto di ATP²³. Tuttavia, sebbene diversi gruppi abbiano citato la disfunzione mitocondriale nelle neuropatie, questi studi sono limitati alle misurazioni dell’attività nei complessi mitocondriali senza conservazione delle membrane mitocondriali, mancando la valutazione dell’integrità mitocondriale o le misurazioni del contenuto di ATP come parametro per la produzione di ATP mitocondriale. In generale, una corretta valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale e della produzione di ROS richiede l’isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione differenziale in un gradiente percoll/saccarosio. L’isolamento dei mitocondri può anche essere un fattore limitante per il tessuto nervoso sciatico a causa della grande quantità di tessuto necessario e della perdita e interruzione dei mitocondri.

Il presente studio mira a fornire un protocollo per misurare la fisiologia mitocondriale come il consumo di ossigeno mitocondriale e la produzione di ROS nel nervo sciatico, preservando le membrane mitocondriali e senza la necessità di isolare i mitocondri. Questo protocollo è adattato dalle misurazioni del consumo di ossigeno nelle fibre muscolari permeabilizzate²⁴ mediante respirometria ad alta risoluzione (HRR). I vantaggi di questa procedura sono la possibilità di valutare i mitocondri in piccole quantità di tessuto come il nervo sciatico e valutare i parametri mitocondriali in situ, preservando così l’ambiente mitocondriale, la struttura e il profilo bioenergetico, per ottenere un risultato fisiologicamente affidabile. Gli stati respiratori mitocondriali sono stati determinati con substrati e inibitori dopo permeabilizzazione del nervo sciatico per valutare correttamente la bioenergetica mitocondriale e il coefficiente del citocromo c per l’integrità della membrana mitocondriale, fornendo una guida per le fasi della valutazione del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETS) e il calcolo dei parametri essenziali. Questo studio può fornire strumenti per rispondere a domande sui meccanismi fisiopatologici in cui è implicato il metabolismo del nervo sciatico, come le neuropatie periferiche.