Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie
Summary
Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.
Abstract
Mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven begleitet mehrere Krankheiten, die mit peripherer Neuropathie verbunden sind, die durch mehrere Ursachen ausgelöst werden können, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen, Erbkrankheiten und Tumoren. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven der Maus kann aufgrund der geringen Probengröße, einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien im Gewebe und des Vorhandenseins einer Myelinscheide eine Herausforderung darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik minimiert diese Herausforderungen, indem sie ein einzigartiges Permeabilisierungsprotokoll verwendet, das an das für Muskelfasern verwendete Protokoll angepasst ist, um die mitochondriale Funktion des Ischiasnervs zu beurteilen, anstatt die Mitochondrien vom Gewebe zu isolieren. Durch die Messung der fluorimetrischen reaktiven Speziesproduktion mit Amplex Red/Peroxidase und den Vergleich verschiedener mitochondrialer Substrate und Inhibitoren in saponin-permeabilisierten Nerven war es möglich, mitochondriale Atmungszustände, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivität von mitochondrialen Komplexen gleichzeitig nachzuweisen. Daher bietet die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der Beurteilung der mitochondrialen Funktion durch andere Techniken.
Introduction
Mitochondrien sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und erfüllen zahlreiche Zellfunktionen wie den Energiestoffwechsel (Glukose-, Aminosäure-, Lipid- und Nukleotidstoffwechselwege). Als primärer Ort der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind Mitochondrien in mehreren Zellsignalprozessen wie Apoptose von zentraler Bedeutung und beteiligen sich an der Synthese von Eisen-Schwefel (Fe-S) -Clustern, dem Import und der Reifung von mitochondrialen Proteinen sowie der Aufrechterhaltung ihres Genoms und ihrer Ribosomen 1,2,3. Das mitochondriale Membrandynamiknetzwerk wird durch Fusions- und Spaltungsprozesse gesteuert, und sie verfügen auch über Maschinen zur Qualitätskontrolle und Mitophagie 4,5,6.
Mitochondriale Dysfunktion ist mit dem Auftreten mehrerer pathologischer Zustände wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit verbunden7. Störungen der mitochondrialen Funktion werden bei neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie bei der Alzheimer-Krankheit 8,9, der Parkinson-Krankheit 10,11, der amyotrophen Lateralsklerose 12,13 und der Huntington-Krankheit 14,15 . Im peripheren Nervensystem wird ein Verlust der mitochondrialen Funktion in Axonen bei Immunneuropathien wie dem Guillain-Barré-Syndrom 16,17 beobachtet, und in Verbindung mit einer hohen mitochondrialen ROS-Produktion in Axonen führen diese Ereignisse zu einer MAP-Kinase-Aktivierung in Schwann-Zellen18. Dies zeigt, dass die mitochondriale Physiologie nicht nur für eine ortsspezifische Zelle, sondern für ein ganzes Gewebe unerlässlich sein kann. Bei der HIV-assoziierten distalen sensorischen Polyneuropathie (HIV-DSP) spielen Mitochondrien eine Rolle in dem Mechanismus, durch den das HIV-TAT-Protein (Transaktivator of Transkription) es HIV ermöglicht, sich effizient zu replizieren, sowie mehrere andere Rollen bei der HIV-Infektionspathogenese19, 20.
Die Beurteilung der mitochondrialen Physiologie des Ischiasnervs hat sich als wesentliches Ziel für die Untersuchung der Neuropathieherausgestellt 7,21,22. Bei der diabetischen Neuropathie deuten proteomische und metabolomische Analysen darauf hin, dass die meisten molekularen Veränderungen bei Diabetes die mitochondriale oxidative Phosphorylierung des Ischiasnervs und den Fettstoffwechselbeeinflussen 7. Diese Veränderungen scheinen auch frühe Anzeichen für einen durch Fettleibigkeit verursachten Diabeteszu sein 21. In einem Mausmodell der chemotherapieinduzierten schmerzhaften Neuropathie wird eine mitochondriale Beeinträchtigung des Ischiasnervs als Abnahme der oxidativen Phosphorylierung22 und eine Verringerung der Aktivitäten der mitochondrialen Komplexe, des Membranpotentials und des ATP-Gehalts23 nachgewiesen. Obwohl mehrere Gruppen mitochondriale Dysfunktion bei Neuropathien zitiert haben, beschränken sich diese Studien auf die Messungen der Aktivität in mitochondrialen Komplexen ohne Erhaltung der mitochondrialen Membranen, fehlende Bewertung der mitochondrialen Integrität oder Messungen des ATP-Gehalts als Parameter für die mitochondriale ATP-Produktion. Im Allgemeinen erfordert eine ordnungsgemäße Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion die Isolierung von Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation in einem Percoll/Saccharose-Gradienten. Die Isolierung von Mitochondrien kann aufgrund der großen Menge an benötigtem Gewebe und des Verlusts und der Störung der Mitochondrien auch ein limitierender Faktor für Ischiasnervengewebe sein.
Die vorliegende Studie zielt darauf ab, ein Protokoll zur Messung der mitochondrialen Physiologie wie des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion im Ischiasnerv bereitzustellen, wobei die mitochondrialen Membranen erhalten bleiben und keine Mitochondrien isoliert werden müssen. Dieses Protokoll wird aus Sauerstoffverbrauchsmessungen in permeabilisierten Muskelfasern24 durch hochauflösende Respirometrie (HRR) angepasst. Die Vorteile dieses Verfahrens sind die Möglichkeit, Mitochondrien in kleinen Gewebemengen wie dem Ischiasnerv zu bewerten und mitochondriale Parameter in situ zu bewerten, wodurch die mitochondriale Umgebung, Struktur und das bioenergetische Profil erhalten bleiben, um ein physiologisch vertrauenswürdiges Ergebnis zu erhalten. Die mitochondrialen Atmungszustände wurden mit Substraten und Inhibitoren nach der Permeabilisierung des Ischiasnervs bestimmt, um die mitochondriale Bioenergetik und den Cytochrom-c-Koeffizienten für die Integrität der mitochondrialen Membran richtig zu beurteilen und einen Leitfaden für Schritte der Bewertung des mitochondrialen Elektronentransportsystems (ETS) und der Berechnung wesentlicher Parameter zu geben. Diese Studie kann Werkzeuge zur Beantwortung von Fragen in pathophysiologischen Mechanismen liefern, an denen der Ischiasnervenstoffwechsel beteiligt ist, wie z.B. periphere Neuropathien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Krankheiten oder Zustände, die Neuropathien begleiten, haben eine mitochondriale Dysfunktion als Risikofaktor. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven ist unerlässlich, um aufzuklären, wie sich die Mitochondrien bei diesen neurodegenerativen Zuständen verhalten. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist aufgrund der Schwierigkeit der Isolationsmethode und der Materialknappheit mühsam. Daher ist die Entwicklung von Gewebepermeabilisierungstechniken, die keine Isolierung der Mi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde finanziert vom Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Wir danken Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli und Dr. Claudio Masuda für die Unterstützung mit Laboreinrichtungen und Dr. Martha Sorenson für die freundlichen und wertvollen Kommentare zur Verbesserung des Artikels.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referencias
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genética. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
