Внеклеточное истощение глюкозы как косвенная мера поглощения глюкозы в клетках и тканях Ex Vivo

Спрос на измерение поглощения глюкозы растет вместе с острой необходимостью борьбы с эпидемическим ростом множества заболеваний, зависящих от метаболизма глюкозы. Основные механизмы дегенеративных метаболических заболеваний, неврологических и когнитивных расстройств¹, воспалительных² и инфекционных заболеваний³, рака ^4,5, а также старения⁶ зависят от метаболизма глюкозы для получения энергии и ее хранения, анаболических процессов, модификации белка и генов, передачи сигналов, регуляции генов и синтеза и репликации нуклеиновых кислот ^7,8,9 . Сахарный диабет (СД) напрямую связан с нарушением регуляции поглощения глюкозы. СД представляет собой спектр хронических заболеваний, таких как сахарный диабет 1 типа, -2 и -3, гестационный диабет, диабет зрелости молодых людей и другие типы этого заболевания, вызванные экологическими и / или генетическими факторами. В 2016 году первый Глобальный доклад ВОЗ о диабете продемонстрировал, что число взрослых, живущих с наиболее распространенным СД, увеличилось почти в четыре раза с 1980 года до 422 миллионов взрослых¹⁰, и это число пациентов с СД растет экспоненциально в течение последних нескольких десятилетий. Только в 2019 году, по оценкам, 1,5 миллиона смертей были непосредственно вызваны СД¹⁰. Этот резкий всплеск связан с ростом СД 2 типа и условиями, приводящими к нему, включая избыточный вес и ожирение¹⁰. Пандемия COVID-19 выявила двукратное увеличение смертности у пациентов с СД по сравнению с населением в целом, что свидетельствует о глубокой, но плохо изученной роли метаболизма глюкозы в иммунной^{защите 3}. Профилактика, ранняя диагностика и лечение СД, ожирения и других заболеваний требуют оптимизации измерений поглощения глюкозы различными тканями и выявления факторов окружающей среды¹¹, питания¹², эндокринной^{системы 13}, генетической¹⁴ и эпигенетической¹⁵ факторов, влияющих на поглощение глюкозы.

В исследованиях внутриклеточное и/или тканевое поглощение глюкозы обычно измеряется флуоресцентно меченой глюкозой (FD-глюкоза) in vitro 16,17,18 и in vivo¹⁹. FD-глюкоза стала предпочтительным методом по сравнению с более точными методами с использованием радиоактивно меченой глюкозы²⁰, аналитического масс-спектроскопического анализа²¹, метаболомики²², методов ядерного магнитного резонанса²³ и позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ) ^5,24. В отличие от поглощения глюкозы FD, аналитические методы, требующие большего количества биологического материала, могут включать многоступенчатую подготовку образцов, дорогостоящие инструменты и сложный анализ данных. Эффективные и недорогие измерения поглощения FD-глюкозы в клеточных культурах использовались в экспериментах по доказательству концепции и могут потребовать подтверждения другими методами.

Основой применения FD-глюкозы для исследований поглощения глюкозы является сниженный метаболизм FD-глюкозы по сравнению с эндогенной глюкозой²⁵. Тем не менее, как эндогенная глюкоза, так и FD-глюкоза динамически распределяются между всеми клеточными компартментами для использования в анаболических, катаболических и сигнальных процессах. Компартментализация и зависящая от времени обработка²⁵ FD-глюкозы вмешиваются в измерения флуоресценции и представляют собой основные ограничивающие факторы для использования этого анализа в высокопроизводительных скрининговых экспериментах, кинетическом анализе, 3D-культуре клеток, ко-культурах и экспериментах с тканевым эксплантом. Здесь мы приводим данные, демонстрирующие высокую корреляцию между внеклеточным истощением FD-глюкозы и ее внутриклеточным поглощением, предполагая внеклеточное истощение FD-глюкозы в качестве суррогатного измерения внутриклеточного поглощения глюкозы. Измерение внеклеточного истощения глюкозы было применено для подтверждения тканеспецифических различий в поглощении глюкозы у мышей, получавших инсулин и экспериментальный препарат¹⁸ , чтобы обеспечить доказательство принципа этого метода.

Текущий протокол описывает внутриклеточные и внеклеточные (рисунок 1) измерения поглощения глюкозы FD в клетках 3T3-L1. Разделы протокола 1-7 объясняют культуру и рост клеток в течение 48 ч; клеточное голодание, стимуляция и базовые внеклеточные измерения; и постстимуляционные измерения внеклеточной FD-глюкозы и внутриклеточные измерения FD-глюкозы и белка. Раздел 8 протокола описывает измерение ex vivo внеклеточного поглощения FD-глюкозы в тканях, рассеченных у мышей ob/ob в присутствии и отсутствии инсулина и аминокислотного соединения 2 (AAC2), описанного в другом месте¹⁸.