高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微镜在化学成像中的应用的直接比较

拉曼散射现象于1928年由C.V.拉曼¹首次观测到。当入射光子与样品相互作用时，可以自发发生非弹性散射事件，其中光子的能量变化与所分析化学物质的振动跃迁相匹配。该过程不需要使用化学标签，使其成为多功能，无标签的化学分析工具，同时最大限度地减少样品扰动。尽管有其优点，但自发拉曼散射的散射截面较低（通常比红外[IR]吸收横截面低^{10 11} ），这需要较长的采集时间进行分析²。因此，寻求提高拉曼散射过程的灵敏度对于推动拉曼技术进行实时成像至关重要。

大大提高拉曼散射灵敏度的一种有效方法是通过相干拉曼散射（CRS）过程，其中两个激光脉冲通常用于激发分子振动转变^3，4。当两种激光器之间的光子能量差与样品分子的振动模式相匹配时，将产生强烈的拉曼信号。用于成像的两种最常用的稀而实过程是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）⁵。在过去的二十年中，技术发展已经使CARS和SRS显微镜技术成为无标记定量和阐明生物样品中化学变化的强大工具。

CARS显微镜的化学成像可以追溯到1982年，当时激光扫描首次应用于获取CARS图像，由Duncan等人⁶演示。在激光扫描多光子荧光显微镜⁷的广泛应用之后，CARS显微镜的现代化大大加快了。Xie小组使用高重复率激光器的早期工作已经将CARS转变为一个高速，无标记的化学成像平台，用于表征生物样品中的分子^8，9，10。CARS成像的主要问题之一是存在非共振背景，这会降低图像对比度并扭曲拉曼光谱。已经做出了许多努力来减少非共振背景^{11，12，13，14，15} 或从CARS光谱^16，17中提取共振拉曼信号。另一个大大推进该领域的进步是高光谱CARS成像，它允许在每个图像像素上进行光谱映射，化学选择性提高^{18，19，20，21}。

受激拉曼散射（SRS）是一种比CARS更年轻的成像技术，尽管它是在^22年早些时候发现的。2007年，SRS显微镜报告使用低重复率激光源²³。很快，几个小组展示了使用高重复率激光^{器24，25，26}的高速SRS成像。与CARS相比，SRS显微镜的主要优点之一是没有非共振背景²⁷，尽管其他背景如交叉相位调制（XPM），瞬态吸收（TA），双光子吸收（TPA）和光热（PT）效应，也可能发生在SRS²⁸上。此外，SRS信号和样品浓度具有线性关系，不像CARS具有二次信号浓度依赖性²⁹。这简化了化学定量和光谱分离。多色和高光谱SRS已经以不同的形式发展^{30，31，32，33，34，35，36}，光谱聚焦是化学成像最流行的方法之一^37，38。

CARS和SRS都需要将泵浦和斯托克斯激光束聚焦到样品上，以匹配分子的振动跃迁以进行信号激发。汽车和SRS显微镜也有很多共同点。然而，这两个过程背后的物理学，以及这些显微镜技术中涉及的信号检测存在差异^3，39。CARS是一个参数化过程，没有净光子分子能量耦合³。然而，SRS是一个非参数过程，并且有助于光子和分子系统之间的能量转移²⁷。在CARS中，产生反斯托克斯频率的新信号，而SRS表现为泵浦和斯托克斯激光束之间的能量转移。

汽车信号满足方程 （1）²⁸。

（1）

同时，SRS信号可以写为等式（2）²⁸。

（二）

在这里， 我_p、 I_s、 I_汽车和 ΔI_SRS 分别是泵波束、斯托克斯波束、汽车信号和 SRS 信号的强度。χ^（3） 是样品的三阶非线性光学敏感性，是由实部和虚部组成的复数值。

这些方程表示CARS和SRS的光谱图和信号浓度依赖性。物理场的差异导致这两种显微镜技术具有不同的检测方案。CARS中的信号检测通常涉及新生成的光子的光谱分离和使用光电倍增管（PMT）或电荷耦合器件（CCD）进行检测;对于SRS，泵和斯托克斯光束之间的能量交换通常通过使用光调制器的高速强度调制和使用与锁定放大器配对的光电二极管（PD）进行解调来测量。

尽管近年来在CARS和SRS领域都发表了许多技术发展和应用，但在同一平台上没有对这两种CRS技术进行系统比较，特别是对于高光谱CARS和SRS显微镜。在灵敏度、空间分辨率、光谱分辨率和化学分离能力方面的直接比较将使生物学家能够选择化学定量的最佳模式。在该协议中，提供了基于飞秒激光系统和光谱聚焦构建具有高光谱CARS和SRS模态的多模态成像平台的详细步骤。这两种技术在光谱分辨率，检测灵敏度，空间分辨率和细胞成像对比度方面进行了正向比较。