Microsporidia संक्रमण के एक Caenorhabditis elegans मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का अध्ययन
Summary
माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी नेमाटोसिडा पेरिसी द्वारा Caenorhabditis elegans का संक्रमण कीड़े को संतान पैदा करने में सक्षम बनाता है जो एक ही रोगज़नक़ के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं। यह विरासत में मिली प्रतिरक्षा का एक उदाहरण है, एक खराब समझी जाने वाली एपिजेनेटिक घटना। वर्तमान प्रोटोकॉल एक आनुवंशिक रूप से असभ्य कृमि मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा के अध्ययन का वर्णन करता है।
Abstract
विरासत में मिली प्रतिरक्षा का वर्णन है कि कैसे कुछ जानवर अपनी संतानों को पिछले संक्रमण की “स्मृति” पर पारित कर सकते हैं। यह उनकी संतानों में रोगज़नक़ प्रतिरोध को बढ़ावा दे सकता है और अस्तित्व को बढ़ावा दे सकता है। जबकि विरासत में मिली प्रतिरक्षा को कई अकशेरुकी में रिपोर्ट किया गया है, इस एपिजेनेटिक घटना के अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं। प्राकृतिक माइक्रोस्पोरिडियन रोगज़नक़ नेमाटोसिडा पेरिसी द्वारा Caenorhabditis elegans के संक्रमण के परिणामस्वरूप कीड़े संतान पैदा करते हैं जो माइक्रोस्पोरिडिया के लिए मजबूत प्रतिरोधी होते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल सरल और आनुवंशिक रूप से असभ्य एन parisii –C. elegans संक्रमण मॉडल में intergenerational प्रतिरक्षा के अध्ययन का वर्णन करता है। वर्तमान लेख C. elegans को संक्रमित करने और प्रतिरक्षा-प्राइमेड संतानों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है। माइक्रोस्पोरिडिया के लिए धुंधला और माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण की कल्पना करके माइक्रोस्पोरिडिया संक्रमण के प्रतिरोध को मापने के लिए भी तरीके दिए गए हैं। विशेष रूप से, विरासत में मिली प्रतिरक्षा माइक्रोस्पोरिडिया द्वारा मेजबान सेल आक्रमण को रोकती है, और सीटू संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति का उपयोग आक्रमण की घटनाओं को मापने के लिए किया जा सकता है। प्रतिरक्षा-प्राइम्ड संतानों में उत्पादित माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं की सापेक्ष मात्रा को चिटिन-बाइंडिंग डाई के साथ बीजाणुओं को धुंधला करके परिमाणित किया जा सकता है। आज तक, इन विधियों ने विरासत में मिली प्रतिरक्षा की कैनेटीक्स और रोगज़नक़ विशिष्टता के साथ-साथ इसके अंतर्निहित आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला है। ये तकनीकें, सी एलिगन्स अनुसंधान के लिए उपलब्ध व्यापक उपकरणों के साथ, विरासत में मिली प्रतिरक्षा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण खोजों को सक्षम करेंगी।
Introduction
विरासत में मिली प्रतिरक्षा एक एपिजेनेटिक घटना है जिससे रोगजनकों के लिए माता-पिता के संपर्क में संक्रमण-प्रतिरोधी संतानों के उत्पादन को सक्षम किया जा सकता है। इस प्रकार की प्रतिरक्षा स्मृति को कई अकशेरुकी में दिखाया गया है जिसमें अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है और वायरल, बैक्टीरियल और फंगल रोग1 से रक्षा कर सकते हैं। जबकि विरासत में मिली प्रतिरक्षा में स्वास्थ्य और विकास दोनों को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं, इस सुरक्षा के अंतर्निहित आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं। यह आंशिक रूप से है क्योंकि जिन जानवरों में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का वर्णन किया गया है, उनमें से कई अनुसंधान के लिए स्थापित मॉडल जीव नहीं हैं। इसके विपरीत, पारदर्शी सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans में अध्ययन एक व्यापक आनुवंशिक और जैव रासायनिक टूलकिट2,3, एक अत्यधिक एनोटेट जीनोम 4,5, और एक छोटी पीढ़ी के समय से लाभ। दरअसल, C. elegans में अनुसंधान ने epigenetics और जन्मजात प्रतिरक्षा 6,7 के क्षेत्र में मौलिक प्रगति को सक्षम किया है, और यह अब प्रतिरक्षा स्मृति 8,9 का अध्ययन करने के लिए एक स्थापित मॉडल है।
माइक्रोस्पोरिडिया फंगल रोगजनक हैं जो लगभग सभी जानवरों को संक्रमित करते हैं और इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड मनुष्यों में घातक संक्रमण का कारण बनतेहैं। संक्रमण तब शुरू होता है जब एक माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणु ध्रुवीय ट्यूब नामक संरचना का उपयोग करके एक मेजबान सेल में अपनी सेलुलर सामग्री (स्पोरोप्लाज्म) को इंजेक्ट या “आग” लगाता है। परजीवी की इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति के परिणामस्वरूप मेरोन्ट का गठन होता है, जो अंततः परिपक्व बीजाणुओं में अंतर करता है जो सेल11,12 से बाहर निकल सकता है। जबकि ये परजीवी मानव स्वास्थ्य और खाद्य सुरक्षा दोनों के लिए हानिकारक हैं, उनके संक्रमण जीव विज्ञानके बारे में जानने के लिए अभी भी बहुत कुछ है। नेमाटोसिडा पेरिसी एक प्राकृतिक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी है जो विशेष रूप से कीड़े की आंतों की कोशिकाओं में दोहराता है, जिसके परिणामस्वरूप कम मल और अंततः मृत्यु होती है। एन parisii –C. elegans संक्रमण मॉडल दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है: (1) रोगज़नक़ निकासी में autophagy की भूमिका13, (2) कैसे microsporidia संक्रमित कोशिकाओं गैर-lytically14, (3) कैसे रोगजनकों syncytia15 बनाने के द्वारा सेल से सेल से फैल सकते हैं, (4) प्रोटीन N. parisii अपने मेजबान16 के साथ इंटरफ़ेस करने के लिए उपयोग करते हैं, और (5) ट्रांसक्रिप्शनल इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ प्रतिक्रिया (IPR) 17 का विनियमन, १८ ।
C. elegans के संक्रमण के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान काम में वर्णित हैं और अद्वितीय microsporidia जीव विज्ञान को प्रकट करने और संक्रमण के लिए मेजबान की प्रतिक्रिया को विच्छेदित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चिटिन-बाइंडिंग डाई डायरेक्ट येलो 96 (DY96) के साथ दाग वाले निश्चित कीड़े की माइक्रोस्कोपी पूरे आंत में चिटिन युक्त माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं के संक्रमण के प्रसार को दर्शाती है। DY96 धुंधला भी मेजबान फिटनेस के एक रीडआउट के रूप में कीड़े गुरुत्वाकर्षण (भ्रूण का उत्पादन करने की क्षमता) के एक साथ मूल्यांकन के लिए चिटिन युक्त कृमि भ्रूण के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।
हाल के काम से पता चला है कि एन पेरिसी से संक्रमित सी एलिगन्स संतानों का उत्पादन करते हैं जो एक ही संक्रमणके लिए मजबूत रूप से प्रतिरोधी हैं। यह विरासत में मिली प्रतिरक्षा एक पीढ़ी तक रहती है और खुराक पर निर्भर होती है, क्योंकि अधिक भारी संक्रमित माता-पिता से संतान माइक्रोस्पोरिडिया के लिए अधिक प्रतिरोधी होती है। दिलचस्प बात यह है कि एन पेरिसी-प्राइम्ड संतानें भी बैक्टीरियल आंत रोगज़नक़ स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं, हालांकि वे प्राकृतिक रोगज़नक़ ओरसे वायरस19 के खिलाफ संरक्षित नहीं हैं। वर्तमान कार्य से यह भी पता चलता है कि प्रतिरक्षा-प्राइमेड संतान माइक्रोस्पोरिडिया द्वारा मेजबान सेल आक्रमण को सीमित करती है। विधि भी प्रतिरक्षा के संग्रह का वर्णन करता है primed संतानों और कैसे FISH आंतों की कोशिकाओं में एन parisii आरएनए का पता लगाने के लिए मेजबान सेल आक्रमण और बीजाणु फायरिंग20 परख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
साथ में, ये प्रोटोकॉल माइक्रोस्पोरिडिया और सी एलिगेंस में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए एक ठोस आधार प्रदान करते हैं। यह आशा की जाती है कि इस मॉडल प्रणाली में भविष्य का काम विरासत में मिली प्रतिरक्षा के नवजात क्षेत्र में महत्वपूर्ण खोजों को सक्षम करेगा। इन तकनीकों को अन्य मेजबान जीवों में माइक्रोस्पोरिडिया-प्रेरित विरासत में मिली प्रतिरक्षा की जांच के लिए शुरुआती बिंदु होने की भी संभावना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोस्पोरिडिया के अध्ययन का वर्णन करता है और एक सरल और आनुवंशिक रूप से असभ्य एन parisii –C. elegans संक्रमण मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा।
बीजाणु तैयारी एक गहन प्रोट?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी प्रदान करने के लिए विनी झाओ और यिन चेन वान के आभारी हैं। इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (अनुदान # 522691522691) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
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