الجمع بين الطباعة 3D والغزل الكهربائي لتصنيع ورقات صمام القلب المحاكاة الحيوية
Summary
تقدم الطريقة المقدمة طريقة مبتكرة لهندسة هياكل الألياف المحاكاة الحيوية في سقالات ثلاثية الأبعاد (3D) (على سبيل المثال ، وريقات صمام القلب). تم استخدام الهندسة الموصلة المطبوعة بتقنية 3D لتحديد الشكل والأبعاد. كان اتجاه الألياف وخصائصها قابلة للتعديل بشكل فردي لكل طبقة. يمكن تصنيع عينات متعددة في إعداد واحد.
Abstract
أصبح الغزل الكهربائي تقنية تستخدم على نطاق واسع في هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية لأنها توفر إمكانية إنشاء سقالات ليفية (صغيرة) ذات خصائص قابلة للتعديل. كان الهدف من هذه الدراسة هو إنشاء سقالات متعددة الطبقات تحاكي خصائص الألياف المعمارية لمنشورات صمام القلب البشري باستخدام جامعي 3D المطبوعة الموصلة.
تم إنشاء نماذج من شرفات الصمام الأبهري باستخدام برنامج التصميم التجاري بمساعدة الكمبيوتر (CAD). تم استخدام حمض البوليلاكتيك الموصل لتصنيع قوالب المنشورات المطبوعة 3D. تم دمج هذه السلبيات العتبة في الفك السفلي الدوار الدوار المصمم خصيصا. تم نسج ثلاث طبقات من البولي يوريثين على المجمع ، مما يحاكي اتجاه الألياف لصمامات القلب البشرية. تم تقييم بنية السطح والألياف باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). بالإضافة إلى ذلك ، سمح تطبيق صبغة الفلورسنت بالتصور المجهري لبنية الألياف متعددة الطبقات. تم إجراء اختبار الشد لتقييم الخصائص الميكانيكية الحيوية للسقالات.
كانت الطباعة 3D للأجزاء الأساسية لجهاز الغزل الكهربائي ممكنة في وقت قصير لميزانية منخفضة. كانت شرفات الصمام الأبهري التي تم إنشاؤها بعد هذا البروتوكول ثلاثية الطبقات ، بقطر ألياف يبلغ 4.1 ± 1.6 ميكرومتر. كشف الفحص المجهري الفلوري عن طبقات فردية ذات ألياف محاذاة بشكل مختلف ، مع وصول كل طبقة بدقة إلى تكوين الألياف المطلوب. أظهرت السقالات المنتجة قوة شد عالية ، خاصة على طول اتجاه المحاذاة. تتوفر ملفات الطباعة الخاصة بالمجمعين المختلفين كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2 وملف تكميلي 3 وملف تكميلي 4 وملف تكميلي 5.
من خلال بروتوكول الإعداد وسير العمل عالي التخصص ، من الممكن محاكاة الأنسجة ذات هياكل الألياف المعقدة عبر طبقات متعددة. الغزل مباشرة على جامعي المطبوعة 3D يخلق مرونة كبيرة في تصنيع الأشكال 3D بتكاليف إنتاج منخفضة.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في البلدان الغربية 1. على الرغم من إجراء أبحاث مكثفة في هذا المجال ، تشير التقديرات إلى أن عبء مرض صمام القلب التنكسي سيزداد أكثر خلال السنوات القادمة2. يمكن استبدال صمام القلب الجراحي أو التدخلي كخيار علاجي. في هذه المرحلة ، تتوفر صمامات القلب الميكانيكية والاصطناعية الحيوية ، وكلاهما له عيوب فردية. الصمامات الميكانيكية هي الجلطات الدموية وتتطلب مضادات التخثر مدى الحياة. على الرغم من أن الصمامات البيولوجية لا تتطلب مضادات التخثر ، إلا أنها تظهر نقصا في إعادة التشكيل ، وارتفاع معدل التكلس ، والتدهور المصاحب3.
قد تكون صمامات القلب المهندسة بالأنسجة قادرة على معالجة هذه العيوب عن طريق إدخال سقالة ليفية دقيقة في الجسم تسمح بإعادة تشكيل الجسم الحي. تتوفر طرق مختلفة ، على سبيل المثال ، الغزل الكهربائي (ESP) ، وإزالة الخلايا ، والقوالب الدقيقة ، والرش ، ومعطف الغمس ، والطباعة الحيوية 3D. يمكن اختيار هذه الطرق لإنشاء خصائص محددة ، أو كونها أرخص وأسرع ، أو فقط بسبب عدم وجود بدائل. يمكن حتى الجمع بين الأساليب والمواد لإنشاء هياكل أكثر تعقيدا4. على سبيل المثال ، كان ESP تقنية قياسية لإنشاء سقالات في هندسة الأنسجة ، مما يسمح بالجمع بين مواد مختلفة وتعديل أقطار الألياف واتجاهات الألياف والمسامات4. علاوة على ذلك ، تسمح مجموعة متنوعة من تقنيات ما بعد المعالجة بإعادة تشكيل الأنسجة المحسنة ، وتحسين توافق الدم ، والتحلل البيولوجي القابل للتعديل للسقالات المغزولة كهربائيا 5،6،7.
يستخدم ESP الأساسي إما مجمعات ثابتة أو دوارة ، والتي لها تأثير مباشر على درجة محاذاة الألياف وأقطار الألياف التي تم الحصول عليها8. نظرا لقيود التصنيع ، تتكون مجمعات ESP الدوارة الكلاسيكية من أسطوانات دوارة أو أقراص أو أسلاك أو قضبان معدنية. يسمح إدخال الطباعة ثلاثية الأبعاد بإنشاء هندسة جامع أكثر فردية لا تقتصر على تقنيات التصنيع التقليدية. هذا التفرد مفيد بشكل خاص لإنشاء هياكل 3D مثل وريقات صمام القلب.
البنية الطبيعية ثلاثية الطبقات (الليفية ، الإسفنجية ، البطينية) لمنشورات صمام القلب البشري هي استجابة الأنسجة للقوى الميكانيكية وإجهاد القص الذي تتعرض له خلال الدورة القلبية 9,10. يتم توجيه ألياف الليفورا الصفيحية بشكل محيطي ، في حين أن ألياف الصفيحة الإسفنجية محاذاة بشكل عشوائي وألياف الصفيحة البطينية شعاعيا. وبالتالي ، يتم اقتراح طبقة ثلاثية مع اتجاهات الألياف المقابلة لمحاكاة خصائص هذه الصمامات في سقالة هندسية للأنسجة.
يصف بروتوكول سير العمل طريقة مبتكرة لإنتاج وريقات صمام القلب ثلاثية الأبعاد ثلاثية الطبقات باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد والغزل الكهربائي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم خطوة لمراقبة الجودة لضمان توجيه دقيق للألياف في كل طبقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم البروتوكول الموصوف ابتكارين في مجال هندسة الأنسجة (القلبية الوعائية): التصنيع منخفض التكلفة للأشباح المطبوعة بالكامل 3D للغزل الكهربائي واستخدام جامع متعدد الاستخدامات لإنتاج وريقات صمام قلب متعددة الطبقات قابلة للتكيف.
في الآونة الأخيرة ، أصبحت الطباعة ثلاثية الأبعاد أداة قيمة لإنتاج معدات المختبرات ، على سبيل المثال ، المفاعلات الحيوية أو إعدادات التصنيع والاختبار11,12. لذلك ، كان من الممكن تصنيع إعداد الغزل الكهربائي المقدم في هذه الدراسة في فترة زمنية قصيرة وبميزانية معقولة (الجدول 1). هذا يبقى تمشيا مع النتائج السابقة لإنتاج منخفضة التكلفة من إعدادات الغزل الكهربائي باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد13.
علاوة على ذلك ، على حد علم المؤلفين ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها استخدام مادة طباعة 3D موصلة لإنشاء جامع الغزل الكهربائي لمنشورات صمام القلب. حتى الآن ، تم تصنيع جامعي الطباعة ثلاثية الأبعاد إما عن طريق تلبيد الليزر المعدني14 أو باستخدام طباعة البوليمر غير الموصلة والمعالجة اللاحقة اللاحقة بطلاء موصل15. وعلى النقيض من هذا النهج الجديد، فإن هذه الإجراءات في وضع غير موات بشكل كبير لأنها أكثر تكلفة، أو تستغرق وقتا أطول بكثير، أو تتطلب المزيد من العمل اليدوي.
يعتمد الغزل الكهربائي على العديد من المتغيرات التي تؤثر على مورفولوجيا الألياف التي تم إنشاؤها. على الرغم من توفر إعدادات مختلفة للغزل الكهربائي التجاري في السوق ، إلا أن العديد من مجموعات البحث تستخدم إعدادات فردية للغاية لتتناسب مع احتياجاتها المحددة16. مع أخذ ذلك في الاعتبار ، قد تحتاج القيم الموصوفة في هذا البروتوكول (الجهد والمسافة وسرعة الدوران) إلى تكييفها مع الإعدادات الفردية ويجب أن ينظر إليها على أنها نقطة انطلاق بدلا من قيم ثابتة. علاوة على ذلك ، من المعروف أن المعلمات البيئية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نتائج الغزل الكهربائي17,18. لذلك ، يوصى بشدة بالتحكم في درجة الحرارة والرطوبة على الأقل داخل جهاز الغزل الكهربائي. تم الحصول على نتائج الغزل الكهربائي المثلى بين 15-20٪ رطوبة نسبية عند درجة حرارة تتراوح بين 21 و 24 درجة مئوية. لاتباع هذا البروتوكول ، تعد المعدات التالية ضرورية: محرك قادر على تسريع المجمع الذي يزن حوالي 300 جم إلى سرعة ثورة تبلغ 2000 دورة في الدقيقة ، ومضخة حقنة مناسبة لمعدلات تدفق صغيرة الحجم تتراوح بين 1-3 مل / ساعة ، ووحدة إمداد طاقة ثنائية القطب قادرة على ±20 كيلو فولت من التيار المباشر (DC).
تمشيا مع الدراسات السابقة ، كان من الممكن تصور البنية الليفية للسقالات المغزولة كهربائيا بواسطة المجهر الفلوري19. كان من الممكن إثبات الهيكل متعدد الطبقات للسقالة بنجاح ، بما في ذلك اتجاهات الألياف المختلفة. خاصة عند العمل مع طبقات متعددة أو مواد متعددة ، ينبغي اعتبار إدخال أصباغ الفلورسنت إجراء قياسيا لمراقبة الجودة الصارمة. يمكن أن يحسن التقييم البصري للنتائج بعد التغييرات في المعلمات أو بروتوكول سير العمل. لا يمكن التوصية بتطبيق الصبغة في السقالات لاستخدامها في الجسم الحي أو في المختبر. هذا مهم لتجنب التداخل مع الأساليب التحليلية المعمول بها.
يعد محاكاة مورفولوجيا صمام القلب الطبيعية ذات أهمية كبيرة لإنتاج نسخة متماثلة هندسية من الأنسجة لاستخدامها كطرف اصطناعي لصمام القلب (الشكل 4B). وقد تبين أن هندسة الصمام المحددة لها تأثير كبير على إعادة تشكيل20 في الجسم الحي. في هذا السياق ، تعد الطباعة ثلاثية الأبعاد لهندسة النشرة للغزل الكهربائي ذات فائدة ، حيث أن التكرارات سهلة وسريعة التنفيذ. حتى إنتاج هندسات صمام شخصية يمكن تصوره والتطوير اللاحق لنماذج 3D الفردية والشخصية من تشوهات صمام القلب ، على سبيل المثال ، لأغراض التدريس ، أمر ممكن.
يعد المزيد من التحسين لخصائص صمام القلب المصمم بالأنسجة في صميم الجهود البحثية الحالية ، حيث عملت العديد من المجموعات البحثية على تطوير سقالات متعددة الطبقات ذات اتجاهات ألياف محددة. Masoumi et al. سقالات مركبة مصنعة من طبقة سيباكات بوليجليسيرول مصبوبة وحصائر ألياف بوليكابرولاكتون (PCL) المغزولة كهربائيا21. وبالتالي ، يمكن إنشاء طبقة ثلاثية من طبقتين كهربائيتين موجهتين مفصولتين بورقة من سيباكات البولي جليسيرول الدقيقة. ومع ذلك ، على النقيض من السقالات الموجودة في متناول اليد ، لم تكن في شكل 3D ولم تكن تحاكي الطبقة الوسطى (الإسفنج) بشكل كاف. تم اتباع نهج آخر لإنتاج صمام قلب مستوحى من الأنسجة الحيوية من قبل Jana et al.22,23. لقد نجحوا في إنتاج سقالات ثلاثية الطبقات مع ألياف موجهة باستخدام مجمعات الألومنيوم للغزل الكهربائي القائم على PCL. مرة أخرى ، قدمت هذه السقالات أيضا عيوبا مورفولوجية ، حيث أن لها مظهرا 2D فقط ، وتنتشر السقالة النهائية من قبل المتحدثين.
على الرغم من أن البروتوكول يعطي معلومات مفصلة حول كيفية إنتاج وريقات صمام القلب ثلاثية الطبقات 3D ، إلا أن هناك العديد من الخطوات اللازمة لإنشاء طرف اصطناعي فعلي لصمام القلب. يوصى باستخدام دعامة قطرها 24 مم للمنشورات الموضحة هنا. مكملة للدعامة المستخدمة ، يمكن تزويد المنشورات بهياكل دعم إضافية للخياطة. للسماح بأقصى قدر من المرونة ، لا يتم تخصيص المنشورات المعروضة هنا لتصميم دعامة معين. يمكن القيام بذلك ببساطة عن طريق تغيير القالب باستخدام برنامج CAD.
على الرغم من استخدامها في هندسة أنسجة صمام القلب ، إلا أن الطريقة المقدمة ستكون قابلة للتطبيق بسهولة على إعدادات الغزل الكهربائي في جراحة العظام24 ، والمسالك البولية 25 ، وطب الأنف والأذن والحنجرة26 ، وغيرها. إنتاج هياكل 3D متطورة و / أو فردية أمر ممكن من خلال تنفيذ جامعي 3D المطبوعة الأخرى. على الرغم من أن مادة المجمع قد تغيرت ، إلا أن مبدأ الغزل الكهربائي يبقى سليما27. لذلك ، فإن استخدام البوليمرات المختلفة ممكن نظريا ، على الرغم من أن تعديل معلمات الغزل الكهربائي قد يكون ضروريا.
بشكل عام ، يصف البروتوكول المقدم طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتصنيع وريقات صمام القلب متعددة الطبقات. يسمح تطبيق الطباعة ثلاثية الأبعاد بالتكيف السريع والتعديلات على المجمع والإدراجات. هذا يسمح بإنتاج الأطراف الاصطناعية الخاصة بالمريض دون عملية تصنيع معقدة ، على سبيل المثال ، جامعي المعادن. يمكن إنشاء عينات متعددة في تشغيل واحد في ظل ظروف متطابقة. لذلك ، يمكن إجراء اختبارات مدمرة للمواد على العينات مع الاستفادة من وجود (تقريبا) اختبارات متطابقة متبقية لبناء الصمام الفعلي. يهدف إدراج ملفات الطباعة كملفات تكميلية في هذه الدراسة إلى دعم تقدم سقالات صمام القلب متعددة الطبقات. تتمتع تقنية الغزل الكهربائي الجديدة هذه أيضا بإمكانات عالية لمجالات أخرى من الطب التجديدي ، حيث يسهل تنفيذ جامعي التحف المعدلة وغيرها من قوالب الغزل المطبوعة بتقنية 3D.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج العلماء السريريين في طب الأوعية الدموية (PRIME) ، بتمويل من Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) ، رقم المشروع MA 2186/14-1.
Materials
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma – Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
Referencias
- Van Camp, G. Cardiovascular disease prevention. Acta Clinica Belgica. 69 (6), 407-411 (2014).
- Iung, B., Vahanian, A. Epidemiology of valvular heart disease in the adult. Nature Reviews Cardiology. 8 (3), 162-172 (2011).
- Fioretta, E. S., et al. Cardiovascular tissue engineering: From basic science to clinical application. Experimental Gerontology. 117 (1), 1-12 (2019).
- Xue, J., Wu, T., Dai, Y., Xia, Y. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications. Chemical Reviews. 119 (8), 5298 (2019).
- Grande, D., Ramier, J., Versace, D. L., Renard, E., Langlois, V. Design of functionalized biodegradable PHA-based electrospun scaffolds meant for tissue engineering applications. New Biotechnology. 37, 129-137 (2017).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(l-lactic acid) vascular graft coated with poly(l-lactic-co-ε-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(l-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
- Voorneveld, J., Oosthuysen, A., Franz, T., Zilla, P., Bezuidenhout, D. Dual electrospinning with sacrificial fibers for engineered porosity and enhancement of tissue ingrowth. Journal of Biomedical Material Research. 105 (6), 1559-1572 (2017).
- Kishan, A. P., Cosgriff-Hernandez, E. M. Recent advancements in electrospinning design for tissue engineering applications: A review. Journal of Biomedical Materials Research. 105 (10), 2892-2905 (2017).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Buchanan, R. M., Sacks, M. S. Interlayer micromechanics of the aortic heart valve leaflet. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (4), 813-826 (2014).
- Gensler, M., et al. 3D printing of bioreactors in tissue engineering: A generalised approach. PLoS One. 15 (11), 0242615 (2020).
- Grab, M., et al. Customized 3D printed bioreactors for decellularization-High efficiency and quality on a budget. Artificial Organs. 45 (12), 1477-1490 (2021).
- Huang, J., Koutsos, V., Radacsi, N. Low-cost FDM 3D-printed modular electrospray/electrospinning setup for biomedical applications. 3D Printing in Medicine. 6 (1), 8 (2020).
- Fukunishi, T., et al. Preclinical study of patient-specific cell-free nanofiber tissue-engineered vascular grafts using 3-dimensional printing in a sheep model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (4), 924-932 (2017).
- Jana, S., Lerman, A. In vivo tissue engineering of a trilayered leaflet-shaped tissue construct. Regenerative Medicine. 15 (1), 1177-1192 (2020).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomaterialia. 10 (1), 11-25 (2014).
- Wang, X., Ding, B., Yu, J., Yang, J. Large-scale fabrication of two-dimensional spider-web-like gelatin nano-nets via electro-netting. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 86 (2), 345-352 (2011).
- Yang, G. -. Z., Li, H. -. P., Yang, J. -. H., Wan, J., Yu, D. -. G. Influence of working temperature on the formation of electrospun polymer nanofibers. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 55 (2017).
- Ekaputra, A. K., Prestwich, G. D., Cool, S. M., Hutmacher, D. W. Combining electrospun scaffolds with electrosprayed hydrogels leads to three-dimensional cellularization of hybrid constructs. Biomacromolecules. 9 (8), 2097-2103 (2008).
- Motta, S. E., et al. Geometry influences inflammatory host cell response and remodeling in tissue-engineered heart valves in-vivo. Scientific Reports. 10 (1), 19882 (2020).
- Masoumi, N., et al. Tri-layered elastomeric scaffolds for engineering heart valve leaflets. Biomaterials. 35 (27), 7774-7785 (2014).
- Jana, S., Lerman, A. Behavior of valvular interstitial cells on trilayered nanofibrous substrate mimicking morphologies of heart valve leaflet. Acta Biomaterialia. 85, 142-156 (2019).
- Jana, S., Franchi, F., Lerman, A. Trilayered tissue structure with leaflet-like orientations developed through in vivo tissue engineering. Biomedical Materials. 15 (1), 015004 (2019).
- Zhou, Y., Chyu, J., Zumwalt, M. Recent progress of fabrication of cell scaffold by electrospinning technique for articular cartilage tissue engineering. International Journal of Biomaterials. 2018, 1953636 (2018).
- Zamani, M., Shakhssalim, N., Ramakrishna, S., Naji, M. Electrospinning: application and prospects for urologic tissue engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 579925 (2020).
- Heilingoetter, A., Smith, S., Malhotra, P., Johnson, J., Chiang, T. Applications of Electrospinning for Tissue Engineering in Otolaryngology. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 130 (4), 395-404 (2020).
- Xue, J., Xie, J., Liu, W., Xia, Y. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1976-1987 (2017).
