Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

Seguendo il protocollo dettagliato qui riportato per la preparazione di doppi strati lipidici supportati (SLB) in camere di flusso (Figura 1), si può chiaramente riconoscere un modello simile a una macchia nella vista nativa di tutte le condizioni visualizzate (Figura 2). Questo effetto è causato dalla rugosità superficiale del vetro, che generalmente domina il segnale di dispersione e porta a condizioni visivamente indistinguibili (vetro, vetro con SLB o vetro con SLB e proteine attaccate). La presenza di vescicole, tuttavia, è chiaramente distinta a causa della grande sezione trasversale di dispersione delle vescicole e consente l’osservazione della rottura e della fusione delle vescicole in membrane omogenee (Figura 2B e Filmato supplementare 1). Quando si rimuove il segnale di scattering statico della superficie del vetro con un approccio raziometrico che enfatizza gli elementi dinamici all’interno del campo visivo 24,25, si possono scoprire proteine non etichettate che si diffondono sulla membrana (Figura 2D) mentre un SLB vuoto (Figura 2C) o il vetro stesso (Figura 2A) appare come un’immagine rumorosa. Lo sfondo intrinseco delle misurazioni MSPT può essere stimato localmente dividendo ogni valore di pixel attraverso la mediana di n pixel precedenti e successivi del filmato nella stessa posizione dell’immagine (Figura 3). Di conseguenza, le macromolecole appaiono come funzioni isotrope a diffusione puntuale (PSF) il cui movimento sulla membrana può essere osservato, tracciato e quantificato. Infatti, la disponibilità sia del contrasto che del comportamento dinamico consente la relazione diretta della dimensione molecolare di una particella con il suo rispettivo comportamento diffusivo, il tutto senza la necessità di etichettare la particella. Tuttavia, per interpretare il contrasto iSCAT determinato durante gli esperimenti MSPT, è essenziale eseguire una calibrazione che traduca l’ampiezza del segnale in massa molecolare. Ciò può essere ottenuto collegando biomolecole di massa nota a un SLB tramite un complesso biotina-streptavidina-biotina (Figura 4A). Come strategia esemplare, si possono usare varianti biotinilate di albumina sierica bovina (BSA), proteina A (prA), fosfatasi alcalina (AP) e fibronectina (FN), che si legano alla streptavidina (STP) che a sua volta è legata ai lipidi contenenti biotina (Biotinyl Cap PE) nella membrana. Come mostrato nella Figura 4A, il contrasto sempre più pronunciato di queste macromolecole esemplari riflette il peso molecolare crescente dei rispettivi standard biotinilati. Assegnando ogni picco degli istogrammi di contrasto (Figura 4B) alla massa corrispondente dello stato oligomerico della proteina standard, viene rivelata una relazione lineare tra contrasto e massa21,22 e può essere successivamente utilizzata per l’analisi di sistemi macromolecolari sconosciuti (Figura 4C). Un buon esempio che dimostra l’applicabilità e le capacità di MSPT per analizzare i pesi molecolari e quindi studiare gli stati oligomerici e gli eventi di oligomerizzazione è la considerazione dell’aldolasi biotinilata e delle IgG biotinilate (Figura 5). L’aldolasi è comunemente segnalata come un omotetramero32. Tuttavia, la distribuzione di massa risolta da MSPT presenta quattro picchi distinti, che evidenziano la presenza di più popolazioni (Figura 5A). Mentre il primo picco minore corrisponde alla streptavidina non occupata e può essere previsto a causa della configurazione in questo tipo di esperimento, possono essere rilevati anche complessi di aldolasi con solo due subunità (2SU) o sei subunità (6SU) (Figura 5B). È interessante notare che i complessi tetra- ed esamerici aldolasi-streptavidina mostrano un coefficiente di diffusione ridotto rispetto all’aldolasi dimerica e alla streptavidina da soli, indicando un aumento della resistenza viscosa, ad esempio, attraverso l’attaccamento di un secondo lipide biotinilato alla streptavidina. Allo stesso modo, le IgG biotinilate mostrano tre picchi nella distribuzione di massa, con il primo picco che corrisponde di nuovo alla massa di una singola streptavidina. La massa del picco più abbondante corrisponde alla massa di una catena leggera e una pesante (1SU), cioè la metà di un anticorpo IgG. L’anticorpo completo con due metà identiche (2SU) viene rilevato in circa l’11% dei casi. La diminuzione del coefficiente di diffusione con dimensioni complesse crescenti indica interazioni della streptavidina con più di un lipide biotinilato o resistenza aggiuntiva causata dalle IgG attaccate, o entrambe. Oltre alla sola analisi degli stati oligomerici dipendenti dalla membrana, MSPT conferisce anche il particolare vantaggio di correlare il comportamento diffusivo di una macromolecola di interesse con il suo stato oligomerico. I risultati rappresentativi per questo tipo di analisi sono mostrati per l’annessina V (AnV) e la subunità B della tossina del colera (CTxB), che si legano rispettivamente alla dioleoilfosfatidilserina (DOPS) o ai glicosfingolipidi (GM1), incorporati nella membrana (Figura 6A). Entrambe le stime della densità del kernel (KDE) presentano distribuzioni unimodali di massa e diffusione, indicando una singola specie abbondante con comportamento diffusivo simile. La posizione di picco della massa molecolare e del coefficiente di diffusione è risultata essere rispettivamente di 49,8 ± 2,2 kDa e 1,4 ± 0,1 μm2/s per AnV e 62,7 ± 3,1 kDa e 0,4 ± 0,1 μm2/s, rispettivamente, per CTxB. I coefficienti di diffusione misurati sono paragonabili ai valori precedentemente riportati ottenuti da AFM ad alta velocità e FRAP33,34. La massa leggermente ridotta rispetto alla massa della macromolecola prevista (52 kDa per un trimero AnV, 65 kDa per un pentamero CTxB) può indicare la presenza di complessi più piccoli con meno subunità nell’insieme. Mentre la differenza di massa tra le proteine è piccola e vicina al limite di rilevamento specificato del microscopio (≈50 kDa), i loro coefficienti di diffusione differiscono considerevolmente. In una miscela equimolare, ad esempio, confrontando la diffusione della miscela con la distribuzione di AnV e CTxB da sola, si può concludere che AnV è più abbondante sulla membrana rispetto a CTxB (Figura 6B). Tuttavia, se la concentrazione di CTxB è raddoppiata rispetto alla concentrazione di AnV, l’equilibrio viene spostato verso CTxB come proteina predominante sulla membrana. Come illustrato per le miscele di AnV e CTxB, MSPT non solo consente di discriminare le macromolecole associate alla membrana in base al loro peso molecolare, ma consente anche la discriminazione di diverse popolazioni di macromolecole in base al loro comportamento diffusivo. Come per tutte le tecniche di microscopia, alcuni requisiti sperimentali sono cruciali per ottenere la qualità desiderata dei dati. Un esempio importante in questo contesto sono le coperture accuratamente pulite. In generale, questo è considerato un prerequisito per gli esperimenti a singola molecola correlati alla microscopia, ma MSPT è particolarmente sensibile alle impurità del campione. L’aumento della dispersione proveniente dalla superficie vetrata delle coperture non pulite impedisce qualsiasi misurazione quantitativa dell’iSCAT. In particolare, anche lo sporco residuo o le particelle di polvere su vetro non sufficientemente pulito possono causare notevoli distorsioni dell’immagine, riconoscibili come punti luminosi nella modalità di imaging nativo (Figura 7A). Sebbene questi difetti siano rimossi dalla stima di fondo a causa della loro natura statica, la determinazione accurata del contrasto di una particella potrebbe essere compromessa e quindi influenzare negativamente la sua analisi quantitativa. Un altro problema comune riscontrato negli esperimenti MSPT sono le vescicole rimanenti che galleggiano (circondate in arancione) attraverso il campo visivo o vescicole non fuse che sono bloccate (circondate in blu) in una posizione specifica sulla membrana e appaiono come grandi scatterer pulsanti (Figura 7B). Per ridurre al minimo la loro presenza e interferenza con l’acquisizione del film, si consiglia di lavare accuratamente l’SLB prima di aggiungere la proteina e di utilizzare miscele appena preparate di piccole vescicole unilamellari (SUV) e cationi bivalenti. Un fattore che deve essere preso in considerazione per la progettazione di esperimenti di tracciamento delle particelle sensibili alla massa è la densità delle macromolecole associate all’interfaccia di membrana. Elevate densità di particelle sulla membrana possono infatti causare problemi per due motivi: i) Il collegamento di rilevamenti di particelle da fotogrammi consecutivi a traiettorie diventa ambiguo e quindi aumenta la probabilità di errori e coefficienti di diffusione mal valutati. ii) La massa delle particelle, che viene estratta dall’ampiezza del loro corrispondente adattamento delle FPF, viene sistematicamente sottovalutata e i picchi di massa si allargano perché la separazione del segnale di fondo statico dal segnale dinamico delle particelle è sempre più difficile (Figura 7C). Attualmente, la valutazione visiva della qualità dei dati nel processo di acquisizione di video MSPT è difficile sui microscopi commerciali disponibili perché la vista raziometrica implementata nel software di acquisizione utilizza la rimozione dello sfondo stabilita per la fotometria di massa21 invece dell’algoritmo basato sulla mediana descritto qui e nei riferimenti 24,25 (Figura 7D ). La rimozione continua dello sfondo basata sulla media utilizzata per visualizzare le molecole di atterraggio nella fotometria di massa fa sì che le particelle diffuse appaiano come fronti scuri con code luminose, il che rende le macchie altamente anisotrope e interferisce con il montaggio della PSF durante la procedura di rilevamento. Pertanto, l’uso dell’elaborazione delle immagini basata sulla media implementata nel software di acquisizione non è adatto per l’analisi di biomolecole diffuse sulle membrane. Figura 1: Diagramma di flusso del processo delle singole fasi necessarie per analizzare le interazioni proteina-membrana con il tracciamento delle particelle sensibili alla massa (MSPT). Per preparare i campioni per le misurazioni MSPT, i vetrini di copertura in vetro devono essere accuratamente puliti e attivati con un plasma di ossigeno. Dopo il loro assemblaggio in camere di flusso del campione, piccole vescicole unilamellari (SUV) vengono preparate per la formazione di doppio strato lipidico supportato (SLB) e tutti i tamponi di reazione vengono filtrati per ridurre la dispersione di fondo. I SUV vengono aggiunti per formare doppi strati lipidici nelle camere di flusso. Facoltativamente, i cationi bivalenti come gli ioni Ca2+ possono essere aggiunti ai SUV per promuovere la rottura delle vescicole. Infine, basse concentrazioni della proteina di interesse vengono scaricate nella camera di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Vista nativa e raziometrica di superfici esemplari rilevanti per le misurazioni MSPT. Immagini rappresentative della rugosità superficiale di un vetrino (A), durante la formazione di un doppio strato lipidico supportato (B), con un doppio strato lipidico supportato intatto (C) e di proteine esemplari ricostituite su un SLB (D). Tutti e quattro gli esempi vengono visualizzati in modalità nativa, a cui è possibile accedere durante la misurazione stessa, e come immagini ratiometriche elaborate dopo la rimozione dello sfondo basato sulla mediana. Le barre della scala rappresentano 1 μm. Per l’analisi dei dati (vedere il quaderno Jupyter accompagnato; passaggio 9), sono stati utilizzati i seguenti parametri: dimensione mediana della finestra (window_length) = 1001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Diagramma dettagliato delle fasi necessarie per la raccolta e l’analisi dei dati MSPT. Dopo l’acquisizione dei dati per il campione di interesse sul fotometro di massa, i filmati vengono elaborati per rimuovere lo sfondo statico attraverso un approccio mediano scorrevole in termini di pixel. Successivamente, le particelle candidate vengono identificate e adattate da una funzione di diffusione puntuale (PSF) prima del loro collegamento nelle traiettorie delle particelle. Per consentire la determinazione del coefficiente di diffusione per ciascuna particella, viene utilizzata l’analisi dello spostamento quadrato medio (MSD) o della distribuzione della distanza di salto (JDD). In questa fase, i valori di contrasto possono essere trasformati in masse molecolari in base alla relazione di contrasto-massa determinata attraverso la strategia di calibrazione. Come passo finale, le traiettorie possono essere filtrate in base alla loro lunghezza o densità di particelle di membrana e visualizzate mediante stima bidimensionale della densità del kernel (2D-KDE). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Calibrazione della relazione massa-contrasto per le misurazioni MSPT. (A) Quadri raziometrici rappresentativi ottenuti per complessi proteici esemplari standard streptavidina che si diffondono su un doppio strato lipidico supportato contenente una piccola percentuale di lipidi biotinilati (rapporto DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE di 70:29.99:0.01 mol%). Come standard di peso molecolare modello, sono mostrati streptavidina28 monovalente (solo STP) o streptavidina28 bivalente in complesso con albumina sierica bovina biotinilata (BSA), proteina A biotinilata (prA), fosfatasi alcalina biotinilata (AP) o fibronectina biotinilata (FN). I punti candidati sono evidenziati in arancione (cerchi tratteggiati) e i rilevamenti di particelle di successo sono evidenziati in rosso (cerchi solidi). Le barre di scala rappresentano 1 μm. (B) Distribuzioni di densità di probabilità dei valori di contrasto ottenuti per le cinque proteine standard modello. Tutti i dati visualizzati rappresentano distribuzioni raggruppate di tre esperimenti indipendenti per condizione: STP solo n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 e FN n = 71.759 traiettorie. Rispetto al numero di particelle determinato per le membrane con proteine, il numero di particelle rilevate su un doppio strato vuoto è trascurabile a densità di membrana moderate (Figura supplementare 1). I picchi di contrasto considerati per la calibrazione della massa sono contrassegnati attraverso linee continue mentre quelli tratteggiati rappresentano stati oligomerici non considerati. (C) Curva di calibrazione contrasto-massa derivata dai contrasti di picco nel pannello D e dalle rispettive masse di sequenza dei complessi. Le barre di errore visualizzano l’errore standard delle posizioni di picco stimate mediante bootstrap (100 ricampioni con 1.000 traiettorie ciascuna). Per l’analisi dei dati (vedere Notebook Jupyter; passaggio 9), sono stati utilizzati i seguenti parametri: dimensione mediana della finestra (window_length) = 1.001 fotogrammi, soglia di rilevamento (thresh) = 0,00055, intervallo di ricerca (dmax) = 4 pixel, memoria (max_frames_to_vanish) = 0 fotogrammi, lunghezza minima della traiettoria (minimum_trajectory_length) = 7 fotogrammi (solo STP), 9 fotogrammi (BSA/FN), 15 fotogrammi (prA), 10 fotogrammi (AP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Decifrare gli stati oligomerici delle proteine associate alla membrana. (A) Stime 2D della densità del kernel sia del coefficiente di massa che di diffusione della streptavidina tetravalente in complesso con aldolasi biotinilata (pannello sinistro) o con un anticorpo anti-Rabbit IgG di capra modificato con biotina (pannello destro). La ricostituzione di entrambi i complessi è stata eseguita su un doppio strato lipidico supportato contenente DOPC, DOPG e Biotinyl Cap PE in un rapporto di 70:29.99:0.01 mol%, rispettivamente. In totale, sono state incluse 116.787 traiettorie di tre repliche indipendenti per il complesso streptavidina-aldolasi (densità delle particelle di 0,1 μm-2) e 348.405 per il composito streptavidina-IgG (densità delle particelle di 0,1 μm-2). Sono state incluse solo particelle con una lunghezza della traccia di almeno cinque fotogrammi. Vengono presentate distribuzioni di probabilità marginali sia della massa molecolare (in alto) che del coefficiente di diffusione (a destra). La x nera in entrambi i pannelli segna i rispettivi massimi locali del KDE. (B) Confronto di masse oligomeriche determinate per il complesso di streptavidina tetravalente con aldolasi modificata da biotina (pannello di sinistra) o IgG biotinilato (pannello di destra) con, secondo le masse della sequenza, pesi molecolari attesi. L’abbreviazione SU viene introdotta per conto della subunità della proteina di interesse. Le barre di errore visualizzano l’errore standard delle posizioni di picco stimate mediante bootstrap (100 ricampioni con 1.000 traiettorie ciascuna). Per l’analisi dei dati (vedere il notebook Jupyter accompagnato; passaggio 9), sono stati utilizzati i seguenti parametri: dimensione mediana della finestra (window_length) = 1.001 fotogrammi, soglia di rilevamento (trebbiatura) = 0,00055, intervallo di ricerca (dmax) = 4 pixel, memoria (max_frames_to_vanish) = 0 fotogrammi, lunghezza minima della traiettoria (minimum_trajectory_length) = 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Scioglimento del comportamento diffusivo delle proteine native che interagiscono con la membrana annessina V (AnV) e della subunità B (CTxB) della tossina del colera. (A) Stime 2D della densità del kernel sia del coefficiente di massa che di diffusione dell’annessina V (pannello sinistro) e della subunità B della tossina del colera (pannello destro). Per la ricostituzione della membrana AnV e CTxB, sono state utilizzate composizioni lipidiche di 80:20 mol% DOPC a DOPS e 99,99:0,01 mol% DOPC a GM1, rispettivamente. In totale sono state incluse 206.819 traiettorie di tre repliche indipendenti per AnV (densità delle particelle di 0,1 μm-2) e 142.895 traiettorie per CTxB (densità delle particelle di 0,2 μm-2). (B) Stime 2D della densità del kernel delle miscele CTxB e AnV in un rapporto di 1:1 (pannello di sinistra) o 2:1 (pannello di destra), rispettivamente. La ricostituzione di miscele proteiche è stata eseguita su un doppio strato lipidico supportato contenente lipidi DOPC, DOPS e GM1 in un rapporto di 80:19,99:0,01 mol%. In totale sono state incluse 42.696 traiettorie di tre repliche indipendenti per la miscela 1:1 (densità delle particelle di 0,1 μm-2) e 264.561 traiettorie per il rapporto 2:1 (densità delle particelle di 0,3 μm-2). Sia per (A) che per (B), sono state incluse solo particelle con una lunghezza della traccia di almeno cinque fotogrammi. Vengono presentate distribuzioni di probabilità marginali sia della massa molecolare (in alto) che del coefficiente di diffusione (a destra). La x bianca in ogni pannello segna il rispettivo massimo globale del KDE. Per l’analisi dei dati (vedere il notebook Jupyter accompagnato; passaggio 9), sono stati utilizzati i seguenti parametri: dimensione mediana della finestra (window_length) = 1.001 fotogrammi, soglia di rilevamento (trebbiatura) = 0,00055, intervallo di ricerca (dmax) = 4 pixel, memoria (max_frames_to_vanish) = 0 fotogrammi, lunghezza minima della traiettoria (minimum_trajectory_length) = 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Potenziali complicazioni nel corso delle misurazioni MSPT o durante l’analisi dei dati. (A) Immagini rappresentative della rugosità superficiale visualizzate sia nella vista raziometrica nativa che in quella elaborata (rimozione dello sfondo basata sulla mediana) di una diapositiva di vetro di copertura non pulita. In entrambi i casi, i punti luminosi costituiscono impurità superficiali residue che impediscono misurazioni prive di artefatti. (B) Immagini esemplari di vescicole residue nel campo visivo dopo un insufficiente lavaggio della membrana. Sia le vescicole statiche (evidenziate in blu) che quelle diffuse (evidenziate in arancione) comprometteranno la qualità della misurazione a causa rispettivamente della pulsazione e della deformazione o del loro movimento direzionale. (C) Come tecnica a singola particella, MSPT richiede basse densità di particelle (immagine rappresentativa, pannello superiore) per consentire un corretto collegamento e determinazione della massa di ciascuna particella. Nel caso di alte densità di particelle di membrana (pannello centrale), il montaggio delle particelle è compromesso, il che influisce sulla determinazione della massa (vedi pannello inferiore). (D) Immagini raziometriche rappresentative di particelle che si diffondono su un’interfaccia di membrana dopo la rimozione dello sfondo a base media (pannello superiore) o mediana. Per la diffusione delle particelle, la strategia di rimozione dello sfondo basata sulla media produce immagini distorte della PSF della particella, come si può vedere nei piccoli inserti tra il pannello superiore e quello centrale. Al contrario, le PSF di particelle non distorte possono essere ottenute attraverso l’approccio basato sulla mediana. Pannello inferiore: confronto dei profili di linea attraverso il centro della FPF ottenuto dopo la rimozione dello sfondo basato sulla media o sulla mediana. Per tutte le immagini native e raziometriche visualizzate in questa figura, le barre della scala rappresentano 1 μm. Per l’analisi dei dati (vedere il notebook Jupyter accompagnato; passaggio 9), sono stati utilizzati i seguenti parametri: dimensione mediana della finestra (window_length) = 1.001 fotogrammi, soglia di rilevamento (trebbiatura) = 0,00055, intervallo di ricerca (dmax) = 4 pixel, memoria (max_frames_to_vanish) = 0 fotogrammi, lunghezza minima della traiettoria (minimum_trajectory_length) = 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1: Confronto tra membrane prive di proteine e occupate. Immagini rappresentative di un doppio strato lipidico supportato intatto prima (A) e dopo (B) l’aggiunta di streptavidina purificata (STP). I punti candidati che sono stati adattati con successo al modello PSF sono circondati in rosso. (C) Distribuzioni di probabilità di contrasto di particelle rilevate su una membrana vuota (fondo membrana, grigio) e su un doppio strato con particelle di streptavidina diffusive (blu). Entrambe le distribuzioni di probabilità rappresentano i dati aggregati di tre esperimenti indipendenti con identici parametri di acquisizione e analisi dei filmati. Per l’analisi dei dati (vedere il notebook Jupyter accompagnato; passaggio 9), sono stati utilizzati i seguenti parametri: dimensione mediana della finestra (window_length) = 1.001 fotogrammi, soglia di rilevamento (trebbiatura) = 0,00055, intervallo di ricerca (dmax) = 4 pixel, memoria (max_frames_to_vanish) = 0 fotogrammi, lunghezza minima della traiettoria (minimum_trajectory_length) = 7 fotogrammi. Fare clic qui per scaricare questo file. Filmato supplementare 1: Film esemplare che mostra la rottura e la fusione delle vescicole in una membrana omogenea registrata con il fotometro di massa. Dimensione mediana della finestra di elaborazione dell’immagine (window_length) = 1.001 fotogrammi. Barra della scala: 1 μm. Gamma di conteggi della fotocamera: nero = 16.892; bianco = 65.408. Clicca qui per scaricare questo film. Filmato supplementare 2: Filmati esemplari che mostrano la diffusione di complessi di annessina V (in alto) e aldolasi biotinilata (in basso) su un doppio strato come ottenuto dalle misurazioni MSPT. Dimensione mediana della finestra di elaborazione dell’immagine (window_length) = 1.001 fotogrammi. Barra della scala: 1 μm. Intervallo di contrasto di scattering interferometrico: nero = -0,0075; bianco = 0,0075. Clicca qui per scaricare questo film.