Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Folgt man dem detaillierten Protokoll hierin zur Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) in Strömungskammern (Abbildung 1), kann man in der nativen Ansicht aller dargestellten Zustände ein fleckenartiges Muster deutlich erkennen (Abbildung 2). Dieser Effekt wird durch die Oberflächenrauheit des Glases verursacht, die im Allgemeinen das Streusignal dominiert und zu visuell nicht unterscheidbaren Bedingungen führt (Glas, Glas mit SLB oder Glas mit SLB und angehängten Proteinen). Das Vorhandensein von Vesikeln ist jedoch aufgrund des großen Streuquerschnitts der Vesikel deutlich ausgeprägt und ermöglicht die Beobachtung von Vesikelbruch und Fusion zu homogenen Membranen (Abbildung 2B und Ergänzungsfilm 1). Wenn man das statische Streusignal der Glasoberfläche mit einem ratiometrischen Ansatz entfernt, der die dynamischen Elemente innerhalb des Sichtfeldes 24,25 betont, kann man unmarkierte Proteine aufdecken, die auf der Membran diffundieren (Abbildung 2D), während ein leerer SLB (Abbildung 2C) oder Glas selbst (Abbildung 2A) als verrauschtes Bild erscheint. Der inhärente Hintergrund von MSPT-Messungen kann lokal geschätzt werden, indem jeder Pixelwert durch den Median von n vorhergehenden und nachfolgenden Pixeln des Films an derselben Bildposition dividiert wird (Abbildung 3). Infolgedessen erscheinen Makromoleküle als isotrope Punktausbreitungsfunktionen (PSFs), deren Bewegung auf der Membran beobachtet, verfolgt und quantifiziert werden kann. Tatsächlich ermöglicht die Verfügbarkeit von Kontrast und dynamischem Verhalten die direkte Beziehung der Molekülgröße eines Partikels zu seinem jeweiligen diffusiven Verhalten, ohne dass das Partikel markiert werden muss. Um den während MSPT-Experimenten ermittelten iSCAT-Kontrast zu interpretieren, ist es jedoch unerlässlich, eine Kalibrierung durchzuführen, die die Signalamplitude in molekulare Masse übersetzt. Dies kann erreicht werden, indem Biomoleküle bekannter Masse über einen Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplex an ein SLB gebunden werden (Abbildung 4A). Als beispielhafte Strategie kann man biotinylierte Varianten von Rinderserumalbumin (BSA), Protein A (prA), alkalischer Phosphatase (AP) und Fibronektin (FN) verwenden, die an Streptavidin (STP) binden, das selbst an biotinhaltige Lipide (Biotinyl Cap PE) in der Membran gebunden ist. Wie in Abbildung 4A dargestellt, spiegelt der zunehmend ausgeprägte Kontrast dieser beispielhaften Makromoleküle das zunehmende Molekulargewicht der jeweiligen biotinylierten Standards wider. Durch die Zuordnung jedes Peaks der Kontrasthistogramme (Abbildung 4B) zur entsprechenden Masse des Oligomerzustands des Standardproteins ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen Kontrast und Masse21,22 und kann anschließend für die Analyse unbekannter Makromolekülsysteme verwendet werden (Abbildung 4C). Ein gutes Beispiel für die Anwendbarkeit und die Fähigkeiten von MSPT zur Analyse von Molekulargewichten und damit zur Untersuchung von Oligomerzuständen und Oligomerisierungsereignissen ist die Berücksichtigung von biotinylierter Aldolase und biotinyliertem IgG (Abbildung 5). Es wird allgemein berichtet, dass Aldolase ein Homotetramer32 ist. Die von MSPT aufgelöste Massenverteilung weist jedoch vier unterschiedliche Spitzen auf, was das Vorhandensein mehrerer Populationen unterstreicht (Abbildung 5A). Während der erste kleine Peak dem unbesetzten Streptavidin entspricht und aufgrund der Konfiguration in einem solchen Experiment zu erwarten ist, können ebenfalls Aldolasekomplexe mit nur zwei Untereinheiten (2SU) oder sechs Untereinheiten (6SU) nachgewiesen werden (Abbildung 5B). Interessanterweise weisen tetra- und hexamere Aldolase-Streptavidin-Komplexe im Vergleich zu dimerer Aldolase und Streptavidin allein einen reduzierten Diffusionskoeffizienten auf, was auf einen erhöhten viskosen Widerstand hinweist, z.B. durch die Anlagerung eines zweiten biotinylierten Lipids an das Streptavidin. In ähnlicher Weise weist biotinyliertes IgG drei Peaks in der Massenverteilung auf, wobei der erste Peak wieder mit der Masse eines einzelnen Streptavidins übereinstimmt. Die Masse des am häufigsten vorkommenden Peaks entspricht der Masse einer leichten und einer schweren Kette (1SU), d.h. der Hälfte eines IgG-Antikörpers. Der vollständige Antikörper mit zwei identischen Hälften (2SU) wird in etwa 11% der Fälle nachgewiesen. Die Abnahme des Diffusionskoeffizienten mit zunehmender komplexer Größe weist auf Wechselwirkungen des Streptavidins mit mehr als einem biotinylierten Lipid oder einem zusätzlichen Widerstand hin, der durch das angehängte IgG oder beides verursacht wird. Neben der alleinigen Analyse membranabhängiger Oligomerzustände bietet MSPT auch den besonderen Vorteil, das diffusive Verhalten eines interessierenden Makromoleküls mit seinem Oligomerzustand zu korrelieren. Repräsentative Ergebnisse für diese Art der Analyse werden für Annexin V (AnV) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTxB) gezeigt, die an Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) bzw. Glykosphingolipide (GM1) binden, die in die Membran eingebaut sind (Abbildung 6A). Beide Kerndichteschätzungen (KDEs) weisen unimodale Verteilungen von Masse und Diffusion auf, was auf eine einzige reichlich vorhandene Spezies mit ähnlichem diffusivem Verhalten hinweist. Die Spitzenposition der Molekülmasse und des Diffusionskoeffizienten betrug 49,8 ± 2,2 kDa bzw. 1,4 ± 0,1 μm 2/s für AnV bzw. 62,7 ± 3,1 kDa bzw. 0,4 ± 0,1 μm2/s für CTxB. Die gemessenen Diffusionskoeffizienten sind vergleichbar mit zuvor gemeldeten Werten aus Hochgeschwindigkeits-AFM und FRAP33,34. Die leicht reduzierte Masse im Vergleich zur Masse des erwarteten Makromoleküls (52 kDa für ein AnV-Trimer, 65 kDa für ein CTxB-Pentamer) kann auf das Vorhandensein kleinerer Komplexe mit weniger Untereinheiten im Ensemble hinweisen. Während der Massenunterschied zwischen den Proteinen klein ist und nahe der vorgegebenen Nachweisgrenze des Mikroskops (≈50 kDa) liegt, unterscheiden sich ihre Diffusionskoeffizienten erheblich. In einem äquimolaren Gemisch kann man beispielsweise durch den Vergleich der Diffusion des Gemisches mit der Verteilung von AnV und CTxB allein zu dem Schluss kommen, dass AnV auf der Membran häufiger vorkommt als CTxB (Abbildung 6B). Wenn jedoch die Konzentration von CTxB im Vergleich zur Konzentration von AnV verdoppelt wird, verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung CTxB als vorherrschendes Protein auf der Membran. Wie für Mischungen von AnV und CTxB dargestellt, erlaubt MSPT nicht nur, membranassoziierte Makromoleküle nach ihrem Molekulargewicht zu unterscheiden, sondern ermöglicht auch die Unterscheidung verschiedener Makromolekülpopulationen nach ihrem diffusiven Verhalten. Wie bei allen Mikroskopietechniken sind einige experimentelle Anforderungen entscheidend, um die gewünschte Datenqualität zu erreichen. Ein wichtiges Beispiel in diesem Zusammenhang sind gründlich gereinigte Deckgläser. Im Allgemeinen wird dies als Voraussetzung für mikroskopische Einzelmolekülexperimente angesehen, aber MSPT ist besonders empfindlich gegenüber Probenverunreinigungen. Die erhöhte Streuung, die von der Glasoberfläche ungereinigter Deckgläser ausgeht, verhindert eine quantitative iCAT-Messung. Insbesondere Restschmutz oder Staubpartikel auf unzureichend gereinigtem Glas können zu bemerkenswerten Bildverzerrungen führen, die im nativen Bildgebungsmodus als helle Flecken erkennbar sind (Abbildung 7A). Obwohl diese Defekte durch die Hintergrundschätzung aufgrund ihrer statischen Natur entfernt werden, kann die genaue Bestimmung des Kontrastes eines Partikels beeinträchtigt werden und somit seine quantitative Analyse negativ beeinflussen. Ein weiteres häufiges Problem, das in MSPT-Experimenten auftritt, sind die verbleibenden Vesikel, die entweder (orange eingekreist) durch das Sichtfeld schweben oder unverschmolzene Vesikel, die an einer bestimmten Position auf der Membran stecken (blau eingekreist) und als große pulsierende Streuer erscheinen (Abbildung 7B). Um ihr Auftreten und ihre Beeinträchtigung der Filmaufnahme zu minimieren, wird empfohlen, die SLB vor der Zugabe des Proteins gründlich zu waschen und frisch zubereitete Mischungen aus kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs) und zweiwertigen Kationen zu verwenden. Ein Faktor, der beim Design von massensensitiven Partikel-Tracking-Experimenten berücksichtigt werden muss, ist die Dichte der Makromoleküle, die mit der Membrangrenzfläche assoziiert sind. Hohe Partikeldichten auf der Membran können in der Tat aus zwei Gründen Probleme verursachen: i) Die Verknüpfung von Partikeldetektionen aus aufeinanderfolgenden Frames mit Trajektorien wird mehrdeutig und erhöht somit die Wahrscheinlichkeit von Fehlern und falsch eingeschätzten Diffusionskoeffizienten. ii) Die Masse der Partikel, die aus der Amplitude ihrer entsprechenden PSF-Anpassung extrahiert wird, wird systematisch unterschätzt und die Massenspitzen erweitern sich, da die Trennung des statischen Hintergrundsignals vom dynamischen Teilchensignal immer schwieriger wird (Abbildung 7C). Derzeit ist die visuelle Beurteilung der Datenqualität bei der Erfassung von MSPT-Videos mit den verfügbaren kommerziellen Mikroskopen schwierig, da die implementierte ratiometrische Ansicht in der Erfassungssoftware die für die Massenphotometrie 21 festgelegte Hintergrundentfernung anstelle des hier und in den Referenzen24,25 beschriebenen medianbasierten Algorithmus verwendet (Abbildung 7D ). Die mittelwertbasierte kontinuierliche Hintergrundentfernung, die zur Visualisierung von Landemolekülen in der Massenphotometrie verwendet wird, bewirkt, dass diffuse Partikel als dunkle Fronten mit hellen Schwänzen erscheinen, wodurch die Flecken hochgradig anisotrop erscheinen und die PSF-Anpassung während des Nachweisverfahrens stören. Somit ist der Einsatz der implementierten mittelwertbasierten Bildverarbeitung in der Erfassungssoftware für die Analyse diffuser Biomoleküle auf Membranen ungeeignet. Abbildung 1: Prozessflussdiagramm der einzelnen Schritte, die zur Analyse von Protein-Membran-Wechselwirkungen mit dem massensensitiven Partikel-Tracking (MSPT) erforderlich sind. Um Proben für MSPT-Messungen vorzubereiten, müssen Glasdeckelobjektträger gründlich gereinigt und mit einem Sauerstoffplasma aktiviert werden. Nach ihrer Montage in Probenflusskammern werden kleine unilamellare Vesikel (SUVs) für die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten (SLB) vorbereitet und alle Reaktionspuffer gefiltert, um die Hintergrundstreuung zu reduzieren. SUVs werden hinzugefügt, um Lipiddoppelschichten in den Durchflusskammern zu bilden. Optional können den SUVs zweiwertige Kationen wie Ca2 + – Ionen zugesetzt werden, um den Vesikelbruch zu fördern. Schließlich werden niedrige Konzentrationen des interessierenden Proteins in die Reaktionskammer gespült. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Native und ratiometrische Ansicht exemplarischer Oberflächen, die für MSPT-Messungen relevant sind. Repräsentative Aufnahmen der Oberflächenrauheit eines Glasdeckelobjektträgers (A), während der Bildung einer gestützten Lipiddoppelschicht (B), mit einer intakten gestützten Lipiddoppelschicht (C) und von exemplarischen Proteinen, die auf einem SLB (D) rekonstituiert sind. Alle vier Beispiele werden im nativen Modus angezeigt, auf den während der Messung selbst zugegriffen werden kann, und als verarbeitete ratiometrische Bilder nach medianbasierter Hintergrundentfernung. Maßstabsbalken repräsentieren 1 μm. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: Mediane Fenstergröße (window_length) = 1001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Diagramm der für die MSPT-Datenerfassung und -analyse erforderlichen Phasen. Nach der Datenerfassung für die Probe von Interesse auf dem Massenphotometer werden Filme verarbeitet, um den statischen Hintergrund durch einen pixelweise gleitenden Medianansatz zu entfernen. Danach werden Kandidatenteilchen identifiziert und durch eine Punktausbreitungsfunktion (PSF) angepasst, bevor sie sich mit Partikelbahnen verbinden. Um die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten für jedes Partikel zu ermöglichen, wird die Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD) oder der Sprungdistanzverteilung (JDD) verwendet. In diesem Stadium können Kontrastwerte entsprechend der durch die Kalibrierstrategie ermittelten Kontrast-Masse-Beziehung in Molekülmassen umgewandelt werden. Als letzter Schritt können Trajektorien basierend auf ihrer Länge oder Membranpartikeldichte gefiltert und durch zweidimensionale Kerndichteschätzung (2D-KDE) visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Kalibrierung des Masse-Kontrast-Verhältnisses für MSPT-Messungen. (A) Repräsentative ratiometrische Rahmen, erhalten für beispielhafte Streptavidin-Standardproteinkomplexe, die auf einer unterstützten Lipiddoppelschicht diffundieren, die einen kleinen Prozentsatz an biotinylierten Lipiden enthält (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE-Verhältnis von 70:29,99:0,01 mol%). Als Modell-Molekulargewichtsstandards werden monovalentes Streptavidin28 (nur STP) oder zweiwertiges Streptavidin28 im Komplex mit entweder biotinyliertem Rinderserumalbumin (BSA), biotinyliertem Protein A (prA), biotinylierter alkalischer Phosphatase (AP) oder biotinyliertem Fibronektin (FN) gezeigt. Kandidatenpunkte werden orange hervorgehoben (gestrichelte Kreise) und erfolgreiche Partikeldetektionen rot hervorgehoben (durchgezogene Kreise). Die Skalenbalken repräsentieren 1 μm. (B) Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen von Kontrastwerten, die für die fünf Modellstandardproteine erhalten wurden. Alle angezeigten Daten stellen gepoolte Verteilungen von drei unabhängigen Experimenten pro Bedingung dar: STP nur n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 und FN n = 71.759 Trajektorien. Im Vergleich zu Partikelzahlen, die für Membranen mit Proteinen bestimmt wurden, ist die Anzahl der auf einer leeren Doppelschicht nachgewiesenen Partikel bei moderaten Membrandichten vernachlässigbar (Ergänzende Abbildung 1). Kontrastspitzen, die für die Massenkalibrierung in Betracht gezogen werden, werden durch durchgehende Linien markiert, während gestrichelte Spitzen Oligomerzustände darstellen, die nicht berücksichtigt werden. (C) Kontrast-zu-Masse-Kalibrierkurve, abgeleitet aus Spitzenkontrasten in Panel D und den jeweiligen Sequenzmassen der Komplexe. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler der durch Bootstrapping geschätzten Spitzenpositionen an (100 Resamples mit jeweils 1.000 Trajektorien). Für die Datenanalyse (siehe Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresch) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 7 Frames (nur STP), 9 Frames (BSA/FN), 15 Frames (prA), 10 Frames (AP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Entschlüsselung von Oligomerzuständen membranassoziierter Proteine. (A) 2D-Korndichteschätzungen sowohl der Masse als auch des Diffusionskoeffizienten von tetravalentem Streptavidin im Komplex mit biotinylierter Aldolase (linkes Panel) oder mit einem Biotin-modifizierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (rechtes Bild). Die Rekonstitution beider Komplexe wurde auf einer unterstützten Lipiddoppelschicht durchgeführt, die DOPC, DOPG und Biotinyl Cap PE in einem Verhältnis von 70:29,99:0,01 Mol% enthält. Insgesamt wurden 116.787 Trajektorien von drei unabhängigen Replikaten für den Streptavidin-Aldolase-Komplex (Partikeldichte von 0,1 μm-2) und 348.405 für den Streptavidin-IgG-Komposit (Partikeldichte von 0,1 μm-2) eingeschlossen. Es wurden nur Partikel mit einer Spurlänge von mindestens fünf Frames aufgenommen. Es werden marginale Wahrscheinlichkeitsverteilungen sowohl der Molekülmasse (oben) als auch des Diffusionskoeffizienten (rechts) dargestellt. Das schwarze x in beiden Panels markiert die jeweiligen lokalen Maxima der KDE. (B) Vergleich der ermittelten Oligomermassen für den Komplex von tetravalentem Streptavidin mit biotinmodifizierter Aldolase (linkes Panel) oder biotinyliertem IgG (rechtes Panel) mit, entsprechend den Sequenzmassen, erwarteten Molekulargewichten. Die Abkürzung SU wird im Namen der Untereinheit “Protein of Interests” eingeführt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler der durch Bootstrapping geschätzten Spitzenpositionen an (100 Resamples mit jeweils 1.000 Trajektorien). Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresh) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Auflösung des diffusiven Verhaltens der nativen membranwechselwirkenden Proteine Annexin V (AnV) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTxB). (A) 2D-Korndichteschätzungen sowohl der Masse als auch des Diffusionskoeffizienten von Annexin V (linkes Bild) und Choleratoxin-Untereinheit B (rechtes Bild). Für die AnV- und CTxB-Membranrekonstitution wurden Lipidzusammensetzungen von 80:20 mol% DOPC zu DOPS bzw. 99,99:0,01 mol% DOPC zu GM1 verwendet. Insgesamt wurden 206.819 Trajektorien von drei unabhängigen Replikaten für AnV (Partikeldichte von 0,1 μm-2) und 142.895 Trajektorien für CTxB (Partikeldichte von 0,2 μm-2) eingeschlossen. (B) 2D-Kerneldichteschätzungen von CTxB- und AnV-Gemischen in einem Verhältnis von 1:1 (linkes Bild) bzw. 2:1 (rechtes Bild). Die Rekonstitution von Proteinmischungen wurde auf einer unterstützten Lipiddoppelschicht durchgeführt, die DOPC-, DOPS- und GM1-Lipide in einem Verhältnis von 80:19,99:0,01 Mol enthielt. Insgesamt wurden 42.696 Trajektorien von drei unabhängigen Replikaten für das 1:1-Gemisch (Partikeldichte von 0,1 μm-2) und 264.561 Trajektorien für das 2:1-Verhältnis (Partikeldichte von 0,3 μm-2) eingeschlossen. Sowohl für (A) als auch für (B) wurden nur Partikel mit einer Spurlänge von mindestens fünf Frames einbezogen. Es werden marginale Wahrscheinlichkeitsverteilungen sowohl der Molekülmasse (oben) als auch des Diffusionskoeffizienten (rechts) dargestellt. Das weiße x in jedem Panel markiert das jeweilige globale Maximum der KDE. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: Mediane Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresch) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 7: Mögliche Komplikationen im Verlauf von MSPT-Messungen oder während der Datenanalyse. (A) Repräsentative Bilder der Oberflächenrauheit, die sowohl in der nativen als auch in der verarbeiteten (medianbasierten Hintergrundentfernung) ratiometrischen Ansicht eines ungereinigten Deckglasobjektträgers angezeigt werden. In beiden Fällen stellen helle Flecken Restoberflächenverunreinigungen dar, die artefaktfreie Messungen behindern. (B) Beispielhafte Bilder von Restvesikeln im Sichtfeld nach unzureichender Membranwäsche. Sowohl statische (blau hervorgehobene) als auch streuende (orange hervorgehobene) Vesikel beeinträchtigen die Messqualität entweder durch Pulsieren und Wackeln bzw. durch ihre Richtungsbewegung. (C) Als Einzelpartikeltechnik erfordert MSPT niedrige Partikeldichten (repräsentatives Bild, oberes Bild), um eine ordnungsgemäße Verknüpfung und Massenbestimmung jedes Partikels zu ermöglichen. Bei hohen Membran-Partikel-Dichten (mittleres Panel) ist die Partikelpassung beeinträchtigt, was sich auf die Massenbestimmung auswirkt (siehe unteres Panel). (D) Repräsentative ratiometrische Bilder von Partikeln, die auf einer Membrangrenzfläche nach entweder mittelbasierter (oberes Panel) oder medianbasierter Hintergrundentfernung diffundieren. Für die Diffusion von Partikeln erzeugt die mittlere Hintergrundentfernungsstrategie verzerrte Bilder der PSF des Partikels, wie sie in den kleinen Einsätzen zwischen dem oberen und mittleren Panel zu sehen sind. Im Gegensatz dazu können unverzerrte Partikel-PSFs durch den medianbasierten Ansatz erhalten werden. Unteres Feld: Vergleich von Linienprofilen durch die Mitte des PSF, erhalten nach mittel- oder medianbasierter Hintergrundentfernung. Für alle nativen und ratiometrischen Bilder, die in dieser Abbildung angezeigt werden, stellen die Maßstabsbalken 1 μm dar. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresh) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Ergänzende Abbildung 1: Vergleich von proteinfreien und besetzten Membranen. Repräsentative Bilder einer intakten gestützten Lipiddoppelschicht vor (A) und nach (B) der Zugabe von gereinigtem Streptavidin (STP). Kandidatenstellen, die erfolgreich an das Modell PSF angepasst wurden, sind rot eingekreist. (C) Kontrastwahrscheinlichkeitsverteilungen von Partikeln, die auf einer leeren Membran (Membranhintergrund, grau) und auf einer Doppelschicht mit diffundierenden Streptavidinpartikeln (blau) nachgewiesen wurden. Beide Wahrscheinlichkeitsverteilungen stellen die gepoolten Daten von drei unabhängigen Experimenten mit identischen Filmerfassungs- und Analyseparametern dar. Für die Datenanalyse (siehe beiliegendes Jupyter-Notebook; Schritt 9) wurden folgende Parameter verwendet: mittlere Fenstergröße (window_length) = 1.001 Frames, Erkennungsschwelle (Dresch) = 0,00055, Suchbereich (dmax) = 4 Pixel, Speicher (max_frames_to_vanish) = 0 Frames, minimale Trajektorienlänge (minimum_trajectory_length) = 7 Frames. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzungsfilm 1: Beispielhafter Film, der den Bruch und die Verschmelzung von Vesikeln zu einer homogenen Membran zeigt, die mit dem Massenphotometer aufgezeichnet wurde. Bildverarbeitungs-Medianfenstergröße (window_length) = 1.001 Frames. Maßstabsbalken: 1 μm. Kameraanzahlbereich: schwarz = 16.892; weiß = 65.408. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen. Ergänzungsfilm 2: Beispielhafte Filme, die die Diffusion von Annexin-V- (oben) und biotinylierten Aldolase-Komplexen (unten) auf einer Doppelschicht zeigen, wie sie aus MSPT-Messungen gewonnen wurde. Bildverarbeitungs-Medianfenstergröße (window_length) = 1.001 Frames. Maßstabsbalken: 1 μm. Interferometrischer Streukontrastbereich: schwarz = -0,0075; weiß = 0,0075. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.