Summary

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Published: March 16, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Abstract

Dinamik füzyon gözenek açma ve kapama ekzositoz ve endositoza aracılık eder ve kinetiklerini belirler. Burada, konfokal mikroskopinin, primer kültür sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için yama-kelepçe kaydı ile kombinasyon halinde nasıl kullanıldığı ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Üç füzyon modu arasında 1) füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapatılmasını içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profilin plazma zarında tamamen birleşene kadar büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Bu füzyon modlarını tespit etmek için, plazma membranı, plazma zarının sitosol yüzlü broşüründe fosfatidilinositol-4,5-bisfosfata (PtdIns (4,5) P2) bağlanan fosfolipaz C δ (PH-mNG) PH alanı ile tutturulmuş mNeonGreen’i aşırı eksprese ederek etiketlendi; veziküller, veziküler içerik salınımını tespit etmek için floresan yanlış nörotransmitter FFN511 ile yüklendi; ve Atto 655, füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine dahil edildi. Bu üç floresan prob, füzyon gözenek açıklığını, içerik salınımını, füzyon gözenek kapanmasını ve kaynaştırma vezikül boyutu değişikliklerini tespit etmek için canlı kromafin hücrelerinde kare başına ~ 20-90 ms’de aynı anda görüntülendi. Analiz yöntemi, üç füzyon modunu bu floresan ölçümlerinden ayırt etmek için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, prensip olarak, kromafin hücrelerinin ötesindeki birçok salgı hücresine uygulanabilir.

Introduction

Membran füzyonu, sinaptik iletim, kan şekeri homeostazı, immün yanıt ve viral giriş 1,2,3 dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Plazma zarında vezikül füzyonunu içeren ekzositoz, nöronal ağ aktiviteleri gibi birçok önemli fonksiyona ulaşmak için nörotransmitterleri ve hormonları serbest bırakır. Füzyon, veziküler içeriği serbest bırakmak için bir gözenek açar, bundan sonra gözenek, öp ve çalıştır 1,4 olarak adlandırılan kaynaştırıcı vezikülü almak için kapanabilir. Hem geri dönüşümsüz hem de geri dönüşümlü füzyon gözenek açıklığı, tek vezikül füzyonunun füzyon gözenek iletkenlik kayıtlarıyla birleştirilen hücreye bağlı kapasitans kayıtları ile ölçülebilir.

Bu genellikle kaynaştırıcı vezikülün düzleşmesine kadar füzyonun genişlemesini içeren tam çökme füzyonunu ve füzyon gözenek açma ve kapama işlemini içeren öpüşme ve koşmayı içeren, sırasıyla 5,6,7,8,9,10,11,12,13 olarak yorumlanır. . Kromafin hücrelerinde yapılan son konfokal ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme çalışmaları, füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapanmasını (öp ve çalıştır, yakın füzyon olarak da adlandırılır), uzun süre açık gözenekli bir Ω şeklini koruyan füzyon gözenek açıklığını, kalış-füzyon olarak adlandırılan füzyon gözenek açıklığını ve kaynaştırıcı vezikülün plazma zarı ile birleşene kadar küçülmesini doğrudan gözlemlemiştir. 8,14,15,16,17.

Nöronlarda, füzyon gözeneklerinin açılması ve kapanması, füzyon gözeneklerinden daha büyük veziküllere önceden yüklenmiş kuantum noktalarının salınımını gösteren görüntüleme ve sinir terminallerininsalınım yüzünde füzyon gözenek iletkenlik ölçümleri ile tespit edilmiştir 5,18,19. Adrenal kromafin hücreleri, ekzo- ve endositoz20,21’in incelenmesi için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kromafin hücreleri büyük yoğun çekirdekli veziküller içermesine rağmen, sinapslar küçük sinaptik veziküller içerirken, kromafin hücrelerinde ve sinapslarda ekzositoz ve endositoz proteinleri oldukça benzerdir 10,11,12,20,21,22,23.

Burada, sığır adrenal kromafin hücrelerinde elektrofizyoloji ile kombine konfokal görüntüleme yöntemi kullanılarak bu üç füzyon modunu ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Bu yöntem, ekzositozu tespit etmek için floresan sahte nörotransmitterlerin (FFN511) veziküllere yüklenmesini içerir; füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profili doldurmak için banyo çözeltisine Atto 655 (A655) eklenmesi ve plazma zarının, plazma zarı 8,15,24’te PtdIns(4,5)P 2’ye bağlanan fosfolipaz Cδ’nin (PH) PH alanı ile etiketlenmesi. Füzyon gözenek dinamikleri, farklı floresan yoğunluklarındaki değişikliklerle tespit edilebilir. Kromafin hücreleri için tanımlanmış olmasına rağmen, burada açıklanan bu yöntemin prensibi, kromafin hücrelerinin çok ötesinde birçok salgı hücresine yaygın olarak uygulanabilir.

Protocol

NOT: Hayvan kullanım prosedürü NIH kurallarına uymuş ve NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Sığır kromafin hücre kültürü Locke çözeltisini (Tablo 1) ve otoklav aletlerini kromafin hücre kültüründen 1 gün önce hazırlayın. Kültür gününde yerel bir mezbahadan sığır adrenal bezleri alın ve diseksiyondan önce buz gibi soğuk Locke’un çözeltisine batırılmış halde tutun….

Representative Results

Şekil 1 ve Şekil 2’de gösterilen deneysel prosedürleri takiben, sığır adrenal bezlerinden kromafin hücreleri, plazma zarını etiketlemek için PH-mNG ile transfekte edildi; Füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine A655 eklendi; ve floresan sahte nörotransmitter FFN511, salınımın tespiti için veziküllere yüklendi. Daha sonra, FFN511, PH-mNG ve A655’in XY düzlemi konfokal timelapse görüntülemesi, hücre tabanında h…

Discussion

Füzyon gözenek ve transmitter salınımının dinamiklerini ve ayrıca sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu, yakın füzyonu, stay-füzyonu ve shrink-füzyonu tespit etmek için konfokal mikroskobik görüntüleme yöntemi tanımlanmıştır 4,24. Hücreyi depolarize etmek ve böylece ekzo- ve endositozu uyandırmak için elektrofizyolojik bir yöntem tanımlanmıştır. Sistematik konfokal görüntü işleme, füzyon ve fisyon olayları …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmayı destekledikleri için NINDS Intramural Araştırma Programlarına (ZIA NS003009-13 ve ZIA NS003105-08) teşekkür ederiz.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

Referencias

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).

Play Video

Citar este artículo
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

View Video